葛根素对骨癌痛大鼠的治疗效果作用机制研究

曹媛媛，杨荷雨，朱海丽（通讯作者）

（湖北科技学院医学部药学院 湖北 咸宁 437100）

骨癌痛是晚期癌症患者的常见症状之一，对患者的日常功能状态和生活质量产生负面影响。

骨癌痛主要表现为痛觉过敏和触诱发痛，常规药物治疗难以达到理想的治疗效果，寻找新的治疗骨癌痛的药物具有重大的意义。葛根素（Puerarin）是从葛属的几种豆科植物葛根的根和野葛根中分离出来的生物活性成分，其在慢性缩窄性损伤、糖尿病性神经病变及紫杉醇诱发的化疗神经痛等多种病理性疼痛中具有较好的镇痛作用。然而，当前葛根素的镇痛机制尚不明确。为明确葛根素在癌痛中作用及机制，本研究构建了乳腺癌骨转移疼痛（cancer-induced bone pain，CIBP）小鼠模型，并给予小鼠葛根素鞘内给药，检测其行为学及脊髓炎症相关蛋白表达变化，从而为葛根素作为镇痛药物的开发提供思路。

1.材料和方法

1.1 实验动物和细胞

雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(180 ～200 g)购自湖北省实验动物中心，实验动物合格证号：42000600043734，在12/12 h 光/暗循环、恒湿的空调房间中，并提供适量的食物和水。大鼠乳腺癌细胞MRMT-1购自广州吉妮欧生物科技有限公司，来源RCB。本研究所有动物实验均经湖北科技学院实验动物伦理委员会批准（伦理审批号：2020-01-900）。

1.2 实验药物与试剂

葛根素购于上海源叶生物科技有限公司，货号：S02M9B54875，纯度超过98%。动物组织裂解液，SDSPAGE 凝胶快速配制试剂盒，BCA 蛋白浓度测定试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司；兔抗NLRP3（A12694），兔抗Caspase-1（A0964），兔抗GFAP（A19058），兔抗IL-1β（A1112），购自武汉爱博泰克（ABclonal）公司，鼠抗NF-κB（BF8005），β-actin（AF7018）购自Affinity 公司，辣根过氧化物酶（HRP）标记二抗购自ABclonal 公司。迷你手持均质仪（北京兰杰柯科技有限公司），微型垂直电泳仪（北京韦克斯科技有限公司），多功能微孔酶标仪(美国BioTek 公司)，iBright 显影仪（美国invitrogen 公司），凝胶成像分析系统（美国GE 公司）,速冷冻离心机（德国eppendorf 公司）。

1.3 模型建立及分组处理

适应性喂养7 d后，将大鼠随机分成假手术组（Sham）、模型组（CIBP）和给药组（CIBP+Puerarin），每组各6只。MRMT-1 在含有10%胎牛血清在RPMI1640 中培养，50 U/mL 青霉素和50 μg/mL 链霉菌素在37 ℃含有5%二氧化碳的恒温培养箱中培养。收集乳腺癌细胞MRMT-1 细胞并将其重悬于Hank 的平衡盐溶液（Hank's balanced salt solution，HBSS）中，置冰上备用。胫骨内注射MRMT-1大鼠乳腺癌细胞建立乳腺癌CIBP 模型。假手术组接种同等体积生理盐水；给药组在CIBP 模型建立第14 天后大鼠鞘内给药5 mg/kg 葛根素，注射具体方法如下：大鼠左后肢剃毛并乙醇消毒，采用适量的戊巴比妥钠麻醉，在左胫骨中钻孔，模型组和给药组使用无菌微量注射器向小鼠左胫骨的髓腔缓慢注入大鼠乳腺癌细胞悬液（3.5×10个），缝合并消毒。

1.4 自发缩足次数（Flinches）记录与机械痛阈值（PWT）检测

让SD 大鼠放于30 cm×30 cm×30 cm 的透明盒内，开始实验前，将大鼠在玻璃盒内适应30 min，观察并记录每5 min 内大鼠自发性缩足（或舔爪）次数，出现舔足或者缩足等行为视为阳性反应，记录3 次，计算其缩足次数平均值。使用von Frey 纤维测定PWT。每次测试前，将大鼠置于透明盒中至少30 min 以适应环境。von Frey 细丝垂直于左后爪中心刺穿，维持至少5 s。爪子突然退缩或舔足认为是阳性，反之则为阴性。记录6 次数据后结束检测。根据公式50% PWT（g）=（10）/10 000 计算各组大鼠缩足阈值。

1.5 转棒运动实验

正式实验开始前每天将大鼠放于大鼠转棒疲劳仪上以匀速5 r/min 的速度适应10 min，休息30 min，重复3 次。正式实验时以10 r/min 运动10 s，匀加速10 s，以10 r/min 运动30 s，匀加速10 s，以20 r/min 运动9 min。然后记录大鼠运动的距离（Distance）和在转棒上停留的时间（Latency）。

1.6 免疫印迹法

通过戊巴比妥钠麻醉，脊髓腰段用RIPA 缓冲液加蛋白酶和磷酸酶抑制剂在冰上裂解；组织在4 ℃，以12 000 rpm/min，离心20 min。取上清液加buffer 煮样，用BCA 蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。用聚丙烯酰胺凝胶分离等质量的蛋白质，将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上1 h。在室温下用TBST 配的5%脱脂牛奶封闭膜1 h，然后在4 ℃下与相应的一抗孵育过夜，与辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）二抗（1:10 000）在室温孵育1 小时，灰度值通过Image J软件进行量化。

1.7 统计学方法

2.结果

2.1 葛根素会缓解大鼠骨癌痛行为

与假手术组相比，模型组大鼠自发性缩足次数显著增加，缩足痛阈值明显降低，转棒运动距离减少及停留时间下降，差异有统计学意义（＜0.05）。表示CIBP大鼠痛觉过敏及运动能力受损。鞘内给予葛根素后发现，大鼠自发缩足次数减少，机械痛阈值升高，运动距离增长和停留时间增加，差异均有统计学意义（＜0.05），见图1。表明葛根素给药可显著改善骨癌痛模型大鼠的痛觉运动行为。

图1 葛根素对骨癌痛大鼠行为学的影响（n=6）

2.2 葛根素抑制脊髓组织NF-κB/NLRP3/Caspasse-1信号通路

免疫印迹发现，与假手术组相比，模型组大鼠脊髓核因子κB（NF-κB）、NOD 样受体蛋白3（NLRP3）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（Caspase-1）表达水平均明显增加，差异有统计学意义（＜0.05）；给药后NF-κB、NLRP3、Caspase-1 蛋白表达水平均显著降低（＜0.05 vs 模型组），见图2、表1。

图2 葛根素对骨癌痛大鼠脊髓炎症信号通路表达的影响

表1 葛根素对骨癌痛大鼠脊髓炎症蛋白相对表达水平（± s）

2.3 葛根素抑制脊髓GFAP/IL-1β 表达

免疫印迹发现，与假手术组相比较，模型组脊髓组织GFAP、IL-1β 含量表达显著升高，差异有统计学意义（＜0.05）；葛根素给药后GFAP、IL-1β 含量表达显著降低，差异有统计学意义（＜0.05），见图3、表2。

图3 葛根素对骨癌痛大鼠脊髓炎症蛋白表达的影响

表2 葛根素对骨癌痛大鼠脊髓炎症蛋白相对表达水平（± s）

3.讨论

CIBP 的病理特征包括神经炎症，表现为白细胞浸润增加，胶质细胞激活，促炎介质增加。NLRP3 炎症小体通过介导Caspase-1 激活和促炎细胞因子IL-1β 分泌参与疼痛病理。在患有纤维肌痛（一种慢性疼痛）的患者血液中也发现了NLRP3 和IL-1β 的表达增加。NLRP3的激活和上调介导了大鼠的疼痛状态。特异性NLRP3拮抗剂治疗可减轻癌症诱导骨痛啮齿动物模型和奥沙利铂诱导周围神经病变模型中的机械性痛觉异常，并将脊髓中NLRP3、Caspase-1 和IL-1β 的表达水平恢复到基础水平。

在脑缺血再灌注损伤模型中，葛根素通过抑制星形胶质细胞和小胶质细胞的激活以及多种促炎症因子。在高血糖相关心血管疾病模型中，葛根素给药抑制高葡萄糖诱导的NLRP3 炎性体形成并减少随后的Caspase-1活化，从而发挥心血管保护作用。在脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞中，葛根素给药抑制了NF-κB 的核易位，从而降低促炎介质的产生。在心肌缺血/再灌注损伤模型中，葛根素显著降低了TNF-α、IL-6 和IL-1β的mRNA 和蛋白水平，并降低了NF-κB、NLRP3、切割的Caspase-1、切割的IL-1β 和切割的IL-18 的蛋白质水平。本研究结果显示，乳腺癌细胞注射胫骨14 d 后的大鼠自发缩足次数增加，机械痛阈值下降，运动能力受损，NF-κB、NLRP3、Caspase-1、星形胶质细胞标记物GFAP 和IL-1β 蛋白表达水平均增加，差异有统计学意义（＜0.05）。葛根素鞘内给药后减少大鼠自发缩足次数，增加机械痛阈值，转棒停留时间及运动距离增长，NF-κB、NLRP3、Caspase-1、GFAP 和IL-1β 蛋白表达水平降低，差异有统计学意义（＜0.05）。提示葛根素给药明显降低了CIBP 大鼠脊髓中NF-κB、NLRP3、Caspase-1 和IL-1β 蛋白的表达，并缓解痛觉行为。因此，葛根素可作为CIBP 大鼠的有效辅助疗法，延缓疼痛症状。

综上所述，葛根素可降低NF-κB 介导的炎症信号并发挥镇痛效应，可作为骨癌痛的镇痛药物。