FRBI对子宫癌相关基因FHIT、PTEN和ARID1A表达作用研究

巩转娣，袁肇方，张向博,3，裴梦源，魏锁成，3

(1.西北民族大学 医院，甘肃 兰州 730030；2.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030；3.西北民族大学 生物医学研究中心，甘肃 兰州 730030)

子宫内膜癌和子宫肉瘤是最常见的妇科恶性肿瘤，给妇女健康和生命安全带来极大困扰，而这些病的发生往往与HPV感染、性行为及分娩次数等因素密切相关[1].脆性组氨酸三联体(FHIT)基因是一个高度保守的肿瘤抑制基因[3]，FHIT蛋白在宫颈癌早期表达水平明显降低，因此根据FHIT表达水平的变化可对宫颈癌进行初步诊断[2-3].磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)是一种新的抑癌基因，具有磷酸酯酶活性[4].PTEN在多种人类癌症中发生突变或缺失，其突变常导致子宫、卵巢等多种器官产生肿瘤[5-7].据报道，子宫内膜癌患者血清PTEN水平明显升高，而且随着临床分期进展以及病理分级加重，血清PTEN水平亦逐步升高.子宫内膜癌PTEN高表达者的存活率均明显低于低表达者，因此PTEN血清 水平与子宫内膜癌患者的临床分期及病理分级密切相关.富含AT的交互式域蛋白1A(ARID1A)是SWI/SNF染色质重塑复合物成员，其低表达可导致乳腺癌预后不良[9].ARID1A也是卵巢癌等妇科肿瘤抑癌因子，其表达水平的下降可能是导致肿瘤恶性化的重要原因，但其作用机制尚需研究探讨[10-12].卵泡刺激素(FSH)是一种重要的促卵泡激素卵巢上皮细胞生长促进因子.FSH与其同源受体(FSHR)结合发挥功能.卵巢癌和妇科恶性肿瘤妇女的FSHR水平明显升高[14].因此，抑制FSHR过度表达可有利于抑制妇科恶性肿瘤的发生发展[15].FSH受体结合抑制剂-8(FRBI)不仅阻断了FSH结合,而且还改变了FSH在受体水平上的作用[16].ARID1A、PTEN和FHIT基因与子宫癌的发生发展息息相关.然而，目前FRBI是否影响子宫癌组织中ARID1A、PTEN和FHIT的表达研究甚少，作用及机理尚不清楚,亟待深入研究[16-17].为此本研究旨在探讨FRBI对子宫癌发生相关的FHIT、PTEN和ARID1A基因影响，进一步探讨FRBI对子宫癌的作用及作用机制.

1 材料和方法

1.1 实验材料

ELISA试剂盒购于上海桥杜生物科技有限公司；FRBI由南京肽生物科技有限公司合成；Western-blot法相关试剂和抗体购于艾博抗(上海)贸易有限公司；PCR及反转录试剂盒购于天根生化技术有限公司；小鼠购于兰州大学实验动物中心，许可证号为[SCXK(Gansu)2005-0007];小鼠饲料购于中国兰州泰华饲料有限公司.

1.2 实验方法

1.2.1 试剂配制

FRBI溶液浓度配制：先用10%二甲基亚砜溶解，再用生理盐水稀释至1 mg/mL.

1.2.2 实验动物处理

购买150只21日龄昆明雌鼠，将其装入有自动饮水机的鼠笼，饲养在温度为22～24 ℃、相对湿度为30%～50%的室内.实验之前，将小鼠饲养10天以适应环境，体重为(22.3±1.52)g.10天后将所有小鼠随机分为FRBI组和对照组CG(n=30).FRBI-1、FRBI-2、FRBI-3和FRBI-4组分别肌肉注射，FRBI的剂量为10、20、30和40 mg/kg，空白对照组CG小鼠肌肉注射生理盐水0.2 mL，每天注射1次，连续注射5天(表1).

1.2.3 样品收集和测量

按表1所示的剂量组给药、采样.

表1 实验设计、小鼠用药和取样

1.2.4 血清中FHIT、PTEN、ARID1A浓度检测

为了评价FRBI对血清FHIT、PTEN和ARID1A产生的影响，应用ELISA试剂盒检测血清FHIT、PTEN、ARID1A浓度.在酶标包被板的各空中加40 μL样品稀释液和10 μL待测样品，37 ℃孵育30 min，弃液洗板.加酶标试剂37 ℃孵育30 min，弃液洗板加显色液15 min后终止液终止显色，酶标仪检测各孔在450 nm处的吸光度值，根据制作的标准曲线计算蛋白浓度.标准曲线的相关系数为0.999 6，实验间的变异系数低于6%.

1.2.5 子宫组织中FHIT mRNA表达水平测定

应用Beacon Designer 7.0软件设计FHIT特异性引物(GenBank登录号：AF047699.1)，小鼠GAPDH基因引物(GenBank登录号：NM-008084.3)作为参考基因(表2).引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成.

表2 用于扩增FHIT基因的引物

根据TRIzol试剂说明书提取子宫组织总RNA，将RNA逆转录为cDNA.PCR扩增条件为 95 ℃ 14.5 min， 95 ℃ 28 s、60 ℃ 22 s、72 ℃ 21 s，35个循环.实验重复3次.

1.2.6 FHIT、PTEN、ARID1A蛋白子宫表达水平

与对照组比较*P<0.05；与对照组比较**P<0.01

用TriPure试剂从小鼠子宫组织中提取蛋白，采用Western-blot检测FHIT、PTEN、ARID1A蛋白的表达水平.分别采用兔抗FHIT抗体(ab180806)、兔抗PTEN抗体(ab170941)、兔抗ARID1A抗体(sc-32761)以及兔抗FSH和ERβ多克隆抗体.稀释后4 ℃孵育过夜，然后用二抗(1∶2 000)孵育1 h，化学发光试剂显影，利用Quantity One软件分析.FHIT、PTEN、ARID1A蛋白的相对表达水平为FHIT、PTEN、ARID1A蛋白灰度值与β-actin蛋白灰度值的比值[18-19].

1.2.7 数据统计

采用SPSS v.21.0统计分析数据，以“平均值±标准差”表示，P<0.05为显著性差异，P<0.01为极显著性差异.应用Pearson分析确定FRBI剂量与 FHIT、PTEN、ARID1A间的相关性.

2 结果

2.1 小鼠血清FHIT、PTEN和ARID1A浓度

如图1所示，四个FRBI实验组的血清FHIT浓度逐渐升高.在第20天和第30天，FRBI-3组FHIT浓度显著高于对照组(P<0.05)，其他时间点各组浓度差异无统计学意义.FRBI实验组血清PTEN浓度随FRBI剂量增加而升高,但各组间差异无统计学意义(图1B).FRBI实验组血清ARID1A浓度逐渐升高.在第15天和第20天，FRBI-4组ARID1A浓度与对照组相比显著升高(图1C)(P<0.05)，其他时间点各组浓度差异无统计学意义.结果表明，高剂量FRBI(30 μg/mL和40 μg/mL)可增加小鼠血清中FHIT和ARID1A含量，能促进FHIT和ARID1A生成.

2.2 子宫组织中FHIT mRNA水平

FHIT mRNA在FRBI实验组中的表达水平随FRBI剂量增加而逐渐升高(图2).在第20天和第30天，FRBI-3和FRBI-4组FHIT mRNA水平均高于对照组(P<0.05、P<0.01)，FRBI-4组FHIT mRNA水平明显高于FRBI-1组(P<0.01).在第20天，FRBI-3组和FRBI-4组的FHIT mRNA分别比对照组增加96.01%和116.80%.实验结果表明，FRBI能剂量依赖性地促进小鼠子宫FHIT mRNA表达.

与对照组比较*P<0.05；与对照组比较**P<0.01；与FRBI-1组比较，bP<0.05

2.3 FHIT、PTEN和ARID1A蛋白在子宫组织中的表达水平

如图3所示，与CG组相比，FHIT、PTEN和ARID1A蛋白的表达水平随着FRBI给药剂量的增加而逐渐增加.图3A所示，在第15、20、30天，四个FRBI实验组的FHIT蛋白表达水平均高于CG组(P<0.05，P<0.01)；FHIT蛋白在FRBI-1、FRBI-2、FRBI-3和FRBI-4组中的增量分别为28.03%、69.82%、118.33%和99.46%；在第30天，FRBI-3组FHIT蛋白水平高于FRBI-1组(P<0.01).同样，在第15、20和30天，FRBI-3组PTEN和ARID1A蛋白水平也高于对照组(P<0.05，P<0.01)(图3B、3C).其他时间点各组蛋白表达水平差异无统计学意义.结果表明，高剂量FRBI(30 μg/mL和40 μg/mL)可促进FHIT、PTEN和ARID1A蛋白在小鼠子宫中的表达.

与对照组比较*P<0.05；与对照组比较**P<0.01；与FRBI-1组比较，bP<0.05

2.4 Pearson相关分析

Pearson相关分析显示，FRBI给药剂量与血清FHIT、PTEN、ARID1A浓度和子宫FHIT、ARID1A、FHIT蛋白水平呈显著正相关(P<0.05)(表3).同时，血清FHIT、PTEN和ARID1A浓度分别与子宫FHIT、PTEN和ARID1A蛋白表达水平呈正相关.结果显示，高剂量FRBI可促进FHIT、PTEN和ARID1A蛋白在子宫组织中的表达.

表3 各指标之间的Pearson相关性

3 讨论

宫颈癌是妇科常见癌症.子宫内膜癌约占子宫癌的85%.Ⅰ型子宫内膜癌为雌激素依赖型，Ⅱ型子宫内膜癌为非雌激素依赖型[20-22].探讨与宫颈癌发生相关的分子和基因，可以为子宫癌的抗癌和治疗提供新的分子基础，因此，寻找新的诊断预后标志物意义重大.对FHIT、PTEN和ARID1A基因的系统研究显示FHIT、ARID1A和PTEN基因水平与子宫癌密切相关[23-25].目前对FRBI是否影响ARID1A、PTEN和FHIT基因表达以及与宫颈癌发生关系的研究鲜见，作用和机理不清[7,26].

本研究表明，FRBI组血清ARID1A和PTEN浓度随FRBI剂量增加而升高.FRBI组血清PTEN浓度逐渐升高，FRBI-4组PTEN浓度显著高于CG组；FRBI剂量30 μg/mL和40 μg/mL可显著提高小鼠血清FHIT和ARID1A的浓度；FRBI还可增加小鼠子宫中FHIT、PTEN和ARID1A蛋白的表达水平.前期研究认为,FHIT的表达在早期宫颈癌中明显降低[3]；而血清PTEN水平明显升高，PTEN高表达子宫内膜癌患者的存活率明显下降.ARID1A表达水平的下降可能是导致肿瘤恶性化的重要原因[11,13].本实验结果表明,高剂量FRBI(30 μg/mL或40 μg/mL)可促进ARID1A和PTEN的血清浓度及子宫组织中的表达，与前期报道结果基本一致[12,27].FRBI剂量与血清FHIT、PTEN和ARID1A浓度及子宫表达水平呈正相关.然而，其作用机理仍需进一步深入研究[28].

4 结论

高剂量FRBI(30 μg/mL或40 μg/mL)能促进血清FHIT和ARID1A的产生以及小鼠子宫FHIT、PTEN、ARID1A蛋白和FHIT mRNA的表达水平.FRBI可能通过调节FHIT、PTEN和ARID1A等抑癌基因表达抑制子宫癌的发生发展.本研究结果为系统揭示FHIT、PTEN和ARID1A在癌症发生和综合诊疗中提供新思路，也为研发治癌药物，有效防治子宫癌提供了理论依据.