基于数据挖掘的高频中药钩藤治疗抽动障碍的网络药理学研究*

吴静静，任献青，宋纯东，冯 刚，白 晗

（1.河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450000；2.河南中医药大学儿科医学院，河南 郑州 450046）

抽动障碍（tic disorder，TD）是一种起病于儿童和青少年的慢性神经精神障碍性疾病，以突然、迅速、反复、非节律性、单一或多部位肌肉运动抽动或/和发声抽动为特点[1]。儿童TD患病率为0.8%[2]，而中国儿童该病的患病率高达6.1%[3]，并呈逐年上升的趋势。TD临床表现复杂多样，常见的症状包括眨眼、挑眉、扭颈、耸肩、喉中异声[4]，且94%的TD患儿伴有共患病，包括强迫症状、注意缺陷多动障碍、品行障碍、对立障碍、暴怒发作、焦虑、抑郁和睡眠障碍[5]。本病病情迁延反复，严重影响患儿学习、社会适应能力及心理品质的健康发展[6]，且慢性抽动障碍已对公共卫生安全造成严重负面影响[7]。

本病发病机制尚未明了，可能是脑功能障碍、遗传因素、心理因素、免疫因素和环境因素共同作用的结果[8]。最近有研究表明，包括抽动秽语综合征在内的抽动障碍可能有共同的遗传因素[9]。西医治疗本病常选用抗精神病药物，如氟哌啶醇、哌咪清、硫必利等，但关于抗精神病药物治疗该疾病的疗效和安全性尚存在争议[10]，且副反应较多，如急性肌张力障碍、静坐不能、嗜睡、认知迟钝、药源性烦躁不安、焦虑和抑郁、迟发性运动障碍等，限制了其应用[11]。中医药治疗该病显现出独特的优势，具有较好的疗效且安全性高，成为了多数患儿家长的选择[12]。

网络药理学作为一门新兴学科，将高通量组学技术和生物信息学技术相结合，能够系统揭示与中医证候相关的整个疾病生物网络及子结构间的相互作用关系[13]。鉴于此，本研究通过数据挖掘、网络药理学等医学信息技术对中医儿科优势病种抽动障碍名中医临床经验进行系统整理和深度研究；收集名中医治疗TD的文献，基于数据挖掘，探讨名中医治疗TD的证治规律。在治疗TD处方中，高频中药钩藤性甘、凉，息风止痉，清肝热，平肝阳，为治肝风内动，惊痫抽搐之要药。《药性论》载：“钩藤主小儿惊啼，瘛疭热壅”，故该药值得进行深度挖掘和研究。运用网络药理学，对钩藤治疗TD的起效机制进行探究，为钩藤治疗本病提供有效依据，有利于中医药的推广和深度开发，同时可为进一步的实验研究奠定理论基础。

1 资料与方法

1.1 数据来源及检索策略 选用收录于中国知网、万方数据库及维普数据库的儿童TD的临床文献。检索公式以“抽动障碍”OR“抽动症”OR“抽动秽语综合征”为主题词，检索上述数据库。

1.2 文献纳入和排除标准

1.2.1 纳入标准（1）国家中医药管理局认定的第1～6批全国名老中医药学术经验工作指导老师，诊治儿童TD的相关文献；（2）从事临床一线工作20年及以上，职称为副主任医师及以上的名中医诊治TD的相关文献。

1.2.2 排除标准（1）科普类文章；（2）内容雷同或重复发表；（3）无明确中医处方；（4）病情未得以控制，疗效不确切。

1.3 数据的提取及数据库的建立 根据以上检索公式，在上述数据库共检索出757篇文献，去重后，余454篇；依据纳入标准、排除标准，最终收集有效文献197篇。利用SPSS 23.0统计软件，建立包括ID、文献名、中药的数据库，共纳入诊断明确的有效医案260条。

1.4 数据的规范 参照《中药大辞典》[14]和《中药学》（新世纪第二版）[15]对中药名进行规范。同种药物，具有别名的，统一名称录入，如肉苁蓉、大云统一为肉苁蓉；同一药物，用药部位不同，但功能主治相同，统一名称录入，如茯苓、茯苓皮，统一为茯苓；同一药物，用药部位不同且功能主治不同，则分别录入，如麻黄、麻黄根；炮制方法不同，功能各异的药物予以保留，如生地黄、熟地黄分别录入；以药对出现的药物，拆分后分别录入，如生龙牡，分别录入生龙骨、生牡蛎。

1.5 统计学方法 利用SPSS 23.0统计软件，对现代名中医治疗TD的中药采用频数描述的方法，判定该病常用中药的用药频数及频率，并按功能主治对其进行分类统计。

1.6 钩藤有效成分及作用靶点筛选 运用中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）检索钩藤活性成分，并依据口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且类药性（drug likeness，DL）≥0.18的原则[16]进行筛选；对筛选出的钩藤活性成分，逐一检索每个成分对应的靶蛋白，在Uniprot数据库中将检索到的靶蛋白转化为对应靶基因。

1.7 TD疾病相关基因筛选 运用GeneCards、DisGeNet数据库筛选TD相关靶基因，合并后删除重复值。对钩藤活性成分的作用靶点与TD疾病相关靶点进行韦恩图的绘制，筛选钩藤活性成分作用靶点与TD靶点的交互靶点。

1.8 交互靶点PPI网络构建及钩藤活性成分-关键靶点网络构建（1）钩藤活性成分作用靶点与TD交互靶点PPI网络构建：运用String数据库（https://string-db.org/），将钩藤活性成分作用靶点与TD交互靶点导入，进行蛋白交互作用核心网络（protein-protein interaction，PPI）构建；将构建的上述网络导入Cystoscape 3.8.2软件（http://cytoscape.org/），利用Network Analyzer插件进行网络拓扑属性分析并绘制网络图，同时依据Degree值筛选排名前10位的靶点基因。（2）钩藤活性成分-关键靶点网络构建：将钩藤活性成分及钩藤治疗TD起效的关键靶点导入Cystoscape 3.8.2软件，进行活性成分-关键靶点网络绘制。

1.9 GO分析和KEGG分析 运用DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov/）对钩藤活性成分作用靶点与TD疾病相关靶点的交互靶点，进行基因本体（gene ontology，GO）功能富集分析与京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genesand Genomes，KEGG）通路富集分析。

2 结果

2.1 中药分布 本研究纳入文献197篇，有效医案260条，含中药233味。除甘草外，应用频率较高的中药依次为钩藤（64.2%）、白芍（59.6%）、僵蚕（41.9%）、全蝎（40.8%）、天麻（38.8%）、茯苓（36.5%）、半夏（35.8%）、蝉蜕（31.9%）、石菖蒲（31.5%）。频率≥10%的中药见表1。甘草在诸多方剂中发挥调和药性的作用，应用广泛，经课题组专家商讨，该药在各方中的具体作用未可明晰，故在中药分类统计中，暂不计入。

表1 单味中药频数、频率分布表（频率≥10%）

将治疗抽动障碍频率＞0.3%的中药（除甘草外），按其主治功能进行分类统计，共计为14类，其中频率较高的依次为平肝息风药（22.9%）、解表药（14.4%）、清热药（12.5%）。（见表2）

表2 中药类别分布表（除甘草外）（频率>0.3%）

2.2 钩藤活性成分筛选 运用TCMSP数据库检索钩藤活性成分，根据选OB≥30%且DL≥0.18，筛选出33种活性成分，包括β-谷甾醇（beta-sitosterol）、豆甾醇（Sitosterol）、山奈酚（Kaempferol）、(+)-表儿茶素（ent-Epicatechin）、槲皮素（Quercetin）、去氢钩藤碱（Corynoxeine）、毛钩藤碱（Hirsutine）、育亨宾（Yohimbine）、异钩藤碱（Isorhyncophylline）、钩藤碱（Rhynchophylline）、四氢鸭脚木碱（Tetrahydroalstonine）、喜果苷（vincosidelactam_qt）等。这些活性成分属生物碱类、黄酮类、萜类、酯类等。（见表3）

表3 钩藤活性成分

2.3 TD疾病相关靶点基因筛选 以“tic disorder”为关键词，检索DisGeNet数据库得到33个TD相关靶点基因；通过GeneCards数据库检索到TD相关靶点基因1 189个，根据Relevance score值大于中位数筛选出598个。上述2个数据库检索得到的基因合并后去重，得到TD疾病相关靶点基因共617个。

2.4 钩藤活性成分作用靶点与TD交互靶点筛选 在TCMSP中，对筛选出的钩藤活性成分，逐一检索每个成分对应的靶蛋白，并运用Uniprot数据库，将检索到的靶蛋白转化为对应靶基因，共206个（去重后）。将检索到的206个钩藤靶基因与617个TD疾病相关基因绘制韦恩图，结果显示交互靶点68个，即为钩藤治疗TD起效的关键靶点。（见图1）

图1 钩藤活性成分作用靶点与TD 疾病靶点韦恩图

2.5 交互靶点PPI网络构建及钩藤活性成分-关键靶点网络构建 将钩藤治疗TD起效的关键靶点导入String数据库进行PPI网络构建，结果以tsv文件形式导出，导入Cystoscape 3.8.2软件进行数据可视，运用Network Analyzer插件进行网络拓扑属性分析，得到有68个节点、661条连线的网络图。Degree值排名前10位的依次为：AKT1（Degree=46），FOS（Degree=43），IL6（Degree=42），TNF（Degree=35），CXCL8（Degree=35），VEGFA（Degree=35），EGF（Degree=33），NGF（Degree=33），TP53（Degree=32），PTGS2（Degree=32）。上述靶点可能是钩藤治疗TD起效的关键靶点。（见图2）

图2 关键靶点PPI 网络图

将钩藤活性成分及关键靶点导入Cystoscape 3.8.2软件进行网络构建，该网络共包含100个节点，289条边。图中外围以圆形排列的绿色“V”形图标代表活性成分，中间以矩形阵排列的粉色菱形图标代表关键靶点。该图可直观反应活性成分与关键靶点的相互作用，节点间的连线代表相互作用关系。成分靶点网络拓扑结构分析显示：Degree值排名较前的成分依次为槲皮素（Quercetin）（Degree=38）、育亨宾（Yohimbine）（Degree=21）、谷甾醇（Beta-sitosterol）（Degree=18）。上述活性成分可能在钩藤治疗TD起效的过程中起关键作用。（见图3）

图3 活性成分-关键靶点网络构建

2.6 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析 运用DAVID数据库对钩藤治疗TD起效的关键靶点进行GO分析，筛选P＜0.05的条目，生物过程（biologicalprocess，BP）309条、细胞组分（cellularcomponent，CC）35条、分子功能（molecularfunction，MF）54条。对富集度＞10%的条目进行展示，见图4。其中涉及BP的高富集度条目有药物反应、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调节、信号转导、细胞增殖的正调节、DNA转录的正调节、基因表达的正调节、炎症应答；涉及CC的高富集度条目有质膜、神经元投射、突触后膜、树突、细胞连接；涉及MF的高富集度条目有蛋白质结合、蛋白质同二聚化活性、酶结合、细胞因子活性、生长因子活性、序列特异性DNA结合。将钩藤治疗TD起效的关键靶点导入DAVID数据库，进行KEGG分析，筛选出P＜0.05信号通路83条，对富集度高的信号通路进行可视化展示，见图5。其中富集度高的信号通路涉及神经活性配体-受体相互作用、PI3K-Akt信号通路、钙离子信号通路、T细胞受体信号通路、多巴胺能突触、cAMP信号通路、HTLV-I感染、Toll受体信号通路、NOD样受体信号通路等。结果提示钩藤可能是通过上述多条信号通路发挥治疗TD的起效机制。

图4 关键靶点的GO 生物功能富集分析

图5 关键靶点的KEGG 通路富集分析

3 讨论

TD归属于中医学肝风、瘛疭、抽搐等范畴，中医古籍对本病病名无明确记载，但有一些与临床症状相关的描述，如《素问·至真要大论篇》：“诸风掉眩，皆属于肝”；《素问·阴阳应象大论篇》：“风胜则动”；《小儿药证直诀》：“风病或新或久，皆引肝风，风动而止于头目，目属肝，肝风入于目，上下左右如风吹，不轻不重，儿不胜任，故目连剳也”；《幼科证治准绳·慢惊》：“水生肝木，木为风化，木克脾土，胃为脾之腑，故胃中有风，瘛渐生，其瘛疭症状，两肩微耸，两手下垂，时复动摇不已”。肝为刚脏，主疏泄，主升主动，体阴而用阳。小儿生理特点表现为肝常有余，若肝阳升动太过，肝风循经而上，则阳亢风动，又因风为阳邪，其性开泻，易袭阳位，善行而数变，游走不定。因此TD患儿临床表现多样，常见眨眼、挤眉、摇头、耸肩、鼓腹、四肢抽动、喉中发声等，见症多端，复杂多变，部位交替。

本研究通过数据挖掘，对筛选的197篇文献中260则医案中涉及的中药进行频数分析。结果显示治疗TD常用中药以平肝息风药为主，其中钩藤为使用频数最高的中药。本研究揭示了历代名中医多从“肝风立论”治疗本病，平肝息风是治疗的基本大法。由此可见，数据挖掘能够揭示中医临证经验背后隐藏的规律，有利于中医宝贵经验的总结和传承。

《药性论》载：“钩藤主小儿惊啼，瘛疭热壅。”现代药理学研究表明，钩藤具有镇静、抗惊厥、抗癫痫的作用[17]。MATSUMOTO K等[18]研究表明钩藤提取物及其活性成分具有神经保护作用。SAKAKIBARA I等[19]研究表明，钩藤水提取物吲哚生物碱能抑制小鼠的自发活动，机制可能是其作为多巴胺受体拮抗剂介导中枢多巴胺能系统从而发挥抑制作用。另有研究表明，钩藤中的缝籽嗪甲醚有复合的5-HTIA受体激动剂和5-HT2A/2C受体拮抗剂的作用，能通过阻滞5-HT2受体和部分兴奋5-HTIA受体，抑制小鼠头部的颤搐反应[20]。探究钩藤治疗TD的起效机制具有深远的意义，能够为其临床推广应用提供依据，同时能为进一步的实验研究做前期理论准备。网络药理学被认为是连接中医和现代科学的潜在途径，其有利于解释中药组方与疾病或证候之间的关系，从而有助于中药组方的合理配伍及合成药物的联合用药[21]。

本研究通过网络药理学发现钩藤的活性成分包括β-谷甾醇、钩藤碱、异钩藤碱、山奈酚、槲皮素等。钩藤碱有镇静、抗惊厥的作用，同时对脑缺血损伤具有保护作用，其机制与减少NO生成，抑制脑内的氮气加速系统活性，以及抑制自由基产生和/或增加自由基消除有关[22]。钩藤碱有调节神经元及镇静作用，可能与降低纹状体和海马细胞外液去甲肾上腺素（NE）的含量有关[23-24]。异钩藤碱具有抑制Ca2+内流的作用，对中枢神经系统的突触传递过程有明显的抑制效应，具有明显的抗癫痫和神经保护作用[25]。β-谷甾醇具有免疫调节的功能，有研究发现其作用可能是通过cAMP调节和/或钙/钙调神经磷酸酶非依赖性途径实现的[26]。山萘酚在多数细胞中可引起时间和剂量依赖性的细胞周期改变，能增加G0/G1期及S期细胞数量，是最有效的活性氧自由基清除剂，在免疫调节、疾病预防等方面有着更广泛的作用空间[27]。槲皮素主要通过抗氧化应激、抗炎、调节钙稳态及增强突触的发生和传导，预防神经和胶质密度降低，从而起到神经保护的作用[28]。在缺血性损伤动物模型中，槲皮素处理显著提高了内源性抗氧化酶CU/Zn/锰超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶在海马CA1锥体神经元中的表达水平，显示出强烈的神经保护作用[29]。综上，单味中药同样具有多成分及作用机制不明确的复杂特性，且既往诸多研究已证实钩藤的多种活性成分具有镇静、抗惊厥、保护神经的作用。

钩藤治疗TD起效的关键靶点，部分已被既往研究证实与TD相关，或与神经系统疾病及神经保护显著相关。TD与血清TNF-α、IL-6、IL-12表达水平呈相关性[30-31]。TNF-α具有诱导神经元凋亡，破坏血-脑脊液屏障，加重脑组织损伤的作用[32]。IL-6通过促进炎症反应而在多种中枢神经系统疾病的脑组织损伤中起重要作用，同时发挥抗凋亡和促进神经元修复的脑保护作用[33]。一项对34例TD患儿血清神经生长因子（nerve growth factor，NGF）和胶质细胞源性神经营养因子（glialcelline-derivedneurotrophic factor，GDNF）检测结果显示，血清NGF和GDNF水平之间存在相关性，TD患儿血清的NGF和GDNF水平与健康对照组比较，差异无统计学意义，但不排除NGF和GDNF在抽动障碍发病机制中的作用，且取脑组织样本研究可能会提供更可靠的证据[34]。NGF滴鼻联合运动训练能明显提高APP/PS1转基因小鼠空间学习及记忆能力，其治疗机制可能与抑制APP表达、减少神经元损伤、促进内源性神经细胞增殖及存活有关[35]。AKT1调节的多种细胞过程通过细胞底物的磷酸化进行表达[36]，包括调节代谢、细胞存活、运动、转录和细胞周期进程[37]。AKT1调节异常已被证实与神经系统疾病、亨廷顿舞蹈病、阿尔茨海默病和其他代谢紊乱等相关[38]。由此可见，上述关键靶点的表达可能与钩藤治疗TD起效的机制密切相关。这些靶点包括转录因子、趋化因子、蛋白激酶、神经生长因子、炎症因子、血管内皮生长因子等。

本研究GO分析显示，钩藤治疗TD起效的机制主要涉及RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正向调节、信号转导、炎症应答、凋亡过程负调节、神经元投射、细胞外空间、细胞外区域、细胞连接等。KEGG分析结果主要涉及神经活性配体-受体相互作用、PI3K-Akt信号通路、钙离子信号通路、T细胞受体信号通路、多巴胺能突触、cAMP信号通路、HTLV-I感染、Toll受体信号通路、NOD样受体信号通路等。现阶段TD发病机制尚未明确，可能与大脑多巴胺（DA）功能亢进、5-羟色胺（5-HT）分泌失衡、去甲肾上腺素（NE）失调、γ-氨基丁酸缺乏、乙酰胆碱异常等因素有关[39]。本研究运用网络药理学对钩藤治疗TD起效的分子机制进行探究，运用TCMSP数据库检索钩藤包含的活性成分及结构信息，并查询实验已验证的钩藤药物-靶点组合，充分保证了检索信息的有效性及准确性。目前多项研究表明，TD患儿在纹状体存在DA异常，如DA受体增加、DA转运体聚集性增高、DA释放增加等[40]。HERSHEY T等[41]应用核磁共振发现，与正常儿童比较，TD患者左顶叶、左侧丘脑额叶内侧多巴胺的活动增强。近年来有研究证实突触后多巴胺受体过度敏感或多巴胺过度释放与TD病理生理机制相关[42]。PI3K/AKT信号通路主要由磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）和其下游分子丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B（AKT）两部分组成[43]，广泛存在各种神经细胞中，具有调节细胞生长、分化、自噬、新陈代谢和抗细胞凋亡等细胞生物学作用[44]。异钩藤碱对Aβ诱导的tau蛋白过度磷酸化的神经保护作用与抑制GSK-3β活性和激活PI3K/PKB信号通路密切相关[45]，同时异钩藤碱能抑制Toll受体/核因子-κB通路保护脑缺血再灌注诱导的神经损伤[46]。钩藤碱能通过降低白细胞介素-1β（IL-1β）和脑源性神经营养因子表达阻滞钙离子通道，进而抑制NO的产生，预防NMDA、毒蕈碱M1和5-HT2受体介导的神经毒性，对神经细胞起保护作用[47-48]。TD合并微生物感染者，可能存在细胞免疫紊乱和体液免疫水平降低。感染引起的免疫功能异常可能是抽动障碍的发病机制之一[49]。有研究发现TD患儿T淋巴细胞亚群水平与正常儿童有差异，如TD患儿CD8+明显升高，且治疗后有所下降，因此TD患儿体内存在以CD8+T淋巴细胞为主导的免疫紊乱[50]。匡桂芳等[51]分别对101例抽动障碍患儿和34名健康对照组儿童进行血清HCMV基因定量检测，结果显示抽动障碍患儿血清中HCMV检出率显著高于健康对照组，外周血CD4+、CD4+/CD8+低于健康对照组，而CD8+高于健康对照组。有研究初步证实，肺炎支原体（MP）感染与TD发病有一定关系[52-53]，可能的机制为MP的隐性感染引起非特异性的多克隆B细胞激活，诱导产生自身神经节甙脂抗体，形成神经毒免疫复合物，从而引起神经节的损害[54]。TD患儿存在这样一种亚组，症状在A族乙型溶血性链球菌（GAS）感染后出现或明显加重，抽动障碍可能与A族乙型溶血性化脓性链球菌（GABHS）感染或既往感染相关[55]。综上，已有学者就抽动障碍与多巴胺异常、免疫紊乱、炎症反应、感染的相关性进行探索研究，与本研究结果钩藤治疗TD通过神经递质代谢、中枢神经系统调节、免疫应答、炎症反应等途径起效具有一致性，为下一步实验研究奠定了一定的理论基础。

综上，钩藤的活性成分包括钩藤碱、异钩藤碱、β-谷甾醇、山奈酚、槲皮素等。已有相关实验研究证实钩藤的活性成分具有镇静、抗惊厥，保护神经的作用，下一步实验可重点研究上述活性成分治疗TD的分子机制。钩藤治疗TD的作用靶点包括AKT1、IL6、TNF、VEGFA、EGF、NGF等，已有学者探索了上述靶点与神经系统疾病的密切关系，可作为本研究下一步实验部分验证的重点靶点。钩藤治疗TD的作用通路包括神经活性配体-受体相互作用、PI3K-Akt信号通路、钙离子信号通路、T细胞受体信号通路、多巴胺能突触、HTLV-I感染等通路等，且上述通路在既往实验研究中已被证实与抽动障碍具有相关性。钩藤可通过多成分、多靶点、多通路调控机体神经递质代谢、中枢神经系统调节、免疫应答、炎症反应等发挥对TD的起效机制。依据本研究提供的理论基础，课题组下一步将进行相关实验验证。