竹笋多糖复合酶法提取工艺及其抗氧化活性研究

周芷冉，刘晓翠，田 瑾

（西华大学食品与生物工程学院,四川 成都 610039）

竹子属于古单子生落叶草本植物伞形纲禾本草亚目禾秆草本科，竹笋是竹子的幼体。我国食用竹笋的历史悠久，竹笋是中国的传统森林蔬菜[1]。竹笋营养十分丰富，不仅富含蛋白质、膳食纤维、维生素，还含有多种氨基酸和微量元素[2]，可以促进消化，治疗“三高”，预防癌症等[3]。

竹笋多糖是从竹笋中提取出的一类活性多糖，因为其具有提高人体免疫、抗氧化、防衰老、抗癌防肿瘤等多种生理活性使其具有很重要的保健食疗功能[4]。多项研究表明，多种植物多糖均具有抗氧化作用[5]。竹笋多糖具有较强的羟基自由基、超氧阴离子自由基的清除抑制能力和还原能力[6 -7]。

目前多糖常用的提取方法有酸碱提取法[8-9]、热水浸提法[10]、超声波提取法[11]和微波提取法[12]等。另外，也有使用单一生物酶辅助提取多糖的[13]。由于酶具有专一性且高效[14]，所以现如今使用酶法提取多糖十分热门。该法条件温和，能基本完整地保持多糖的分子结构，在提取工程中，环保无污染，有利于工厂规模化生产[15]，而且相较于其他方法，多糖得率也更高[16-17]。关于复合酶法提取竹笋多糖的研究起步晚，报道也比较少。为此，本研究采用单因素试验和正交试验优化复合酶法提取竹笋多糖的工艺条件，获得最佳提取条件，并测定本实验提取的竹笋多糖的抗氧化活性，以期为竹笋多糖的进一步开发利用和深入研究提供一些参考。

1 材料与设备

1.1 材料与试剂

竹笋，四川亿达丰农业有限公司；90%乙醇、葡萄糖标准品、浓硫酸、果胶酶、苯酚、滤纸，成都市科隆化学品有限公司；纤维素酶、中性蛋白酶、DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼），上海源叶生物科技有限公司；维生素C，华中药业股份有限公司。

1.2 仪器与设备

电子天平DSA224S，赛多利斯科学仪器公司；粉碎机、恒温水浴锅JHH-4，冠森生物科技有限公司；TD-5M 台式低速离心机，四川蜀科仪器有限公司；精密鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；pH 计、抽滤机，郑州长盛实验仪器有限公司；SpectraMax®i3x 酶标仪，美谷分子仪器（上海）有限公司。

2 方法

2.1 原料预处理

取一定量竹笋经清洗、干燥、粉碎、过60 目筛后得到竹笋干粉，干燥处保存。

2.2 酶解法提取多糖

取5 份竹笋粉各1 g 于250 mL 锥形瓶中，按适当的料液比添加蒸馏水并混合均匀，调节pH，加入复合酶（纤维素酶∶果胶酶∶蛋白质酶=1∶1∶1），在设定温度中水浴酶解，抽滤，用蒸馏水洗涤3 次，沸水浴处理15 min 以灭酶，接着离心5 min（3 500 r/min）。得到上层液后使用旋蒸浓缩仪浓缩至原液约四分之一体积后加入4 倍体积95%乙醇溶液4 ℃静置24 h，再离心处理15 min（3 500 r/min）。真空干燥沉淀（40 ℃，12 h）后，得到竹笋多糖[18]。

2.3 竹笋多糖提取率测定

竹笋多糖提取率的测定使用苯酚-硫酸法[19]，葡萄糖标准曲线方程为y=6.828 6x-0.009，R2=0.999。

2.4 复合酶法提取竹笋多糖工艺条件确定

2.4.1 各单酶最佳添加量确定

2.4.1.1 单因素实验

称5 份竹笋粉各1 g，在料液比1∶20，pH 5.0，温度50 ℃，提取时间2 h 的条件下，分别加入不同质量分数（0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%）的纤维素酶提取多糖，依据竹笋多糖提取率，分析纤维素酶添加量对竹笋多糖提取率的影响。每组进行3 次平行试验，结果为其平均值。中性蛋白酶与果胶酶同样按照以上步骤得到竹笋多糖提取率平均值。

2.4.1.2 正交实验

在上述单因素实验基础上，按照表1 进行三因素三水平正交试验，按照2.2 的试验步骤，保持酶解条件不变，以复合酶比为自变量，竹笋多糖提取率为指标。确定提取竹笋多糖的最佳复合酶配比。试验重复3 次，结果取平均值。

表1 复合酶法提取竹笋多糖的正交实验变量水平设计因素与水平

2.4.2 复合酶提取条件的优化

2.4.2.1 单因素实验

分别以其中一个提取条件的因素水平为自变量，保持2.4.1 所确定的最佳酶配比及其他条件不变，按照2.2 的步骤进行试验并记录相关数据，例如研究不同料液比对竹笋多糖提取率影响时，保持复合酶添加量、pH、提取温度和提取时间不变，仅改变料液比为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50。研究不同的复合酶添加量（1%、1.5%、2%、2.5%、3%），提取温度（40、50、60、70 ℃），pH（4、4.5、5、5.5、6）和提取时间（1、1.5、2、2.5、3 h）对于竹笋多糖提取率的影响时，同样依据上述方法，每组分别进行3 次平行测定，取平均值。

2.4.2.2 正交试验

根据上述单因素试验结果，对提取时间、提取温度、pH、复合酶添加量4 个因素开展正交试验确定最佳提取工艺参数（见表2），并考察各因素对竹笋多糖提取率影响关系。

表2 正交实验变量水平设计

2.5 抗氧化活性的测定

2.5.1 竹笋多糖对DPPH 自由基清除能力的测定

首先配制2 mL 不同浓度（0.5，1.0，1.5，2.0，3.0 mg/mL）待测竹笋多糖溶液，分别加2 mL 0.2 mmol/L DPPH 溶液，另用无水乙醇调零，避光放置30 min，在波长517 nm 处测吸光度，进行3 次平行测定，用Vc 作为阳性对照。计算公式[20]如下：

式中：Aj为待测样品溶液+DPPH 溶液的吸光度；Ai为待测样品溶液+无水乙醇溶液的吸光度；Ac为无水乙醇溶液+DPPH 溶液的吸光度。

2.5.2 清除羟基自由基能力的测定

配制10 mmol/L 的硫酸亚铁溶液和10 mmol/L的水杨酸（乙醇）溶液，再将它们依次各取1 mL 加入试管，加入1 mL 不同浓度的竹笋多糖溶液。加8.8 mmol/L 的过氧化氢溶液1 mL 激活反应，37 ℃水浴反应10 min。在510 nm 测吸光度，进行3 次平行测定取平均值，用Vc 做阳性对照[21]。羟基自由基清除率的公式为：

式中：AS为不同浓度待测溶液测得的吸光值；A0为蒸馏水代替待测溶液测得的吸光度值；A1为不加显色剂过氧化氢时溶液的吸光度值。

2.5.3 还原能力的测定

用2.5 mL 0.2 mol/L 磷酸盐缓冲液分别稳定1 mL 不同浓度多糖溶液的pH。再加入2.5 mL 1%的 K3[Fe(CN)6]溶液，50 ℃水浴20 min。冷却后，加入2.5 mL 10%的TCA 溶液，4 000 r/min 离心10 min 后取上清液2.5 mL，加2.5 mL 蒸馏水和0.5 mL 0.1%Fecl3溶液混匀放置1 min，在波长700 nm测吸光度值[22]。每组进行3 次平行测定取平均值，用Vc 溶液对比。

2.5.4 多糖对ABTS 自由基清除能力测定

配制ABTS工作液：1∶1混合ABTS溶液（7.00 mmol/L）与过二硫酸钾溶液（2.45 mmol/L），在25 ℃下避光反应12～16 h 后用pH 7.4 的磷酸盐缓冲液（0.1 mmol/L）稀释，保证上述配制溶液在734 nm 处吸光值处于一定区域（0.7±0.02）之间。取0.4 mL 质量浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 mg/mL的多糖溶液置于试管中，加入4 mL 配制好的ABTS 工作液混匀，避光反应6 min，在734 nm 处测多糖溶液吸光度值[23]。每组3 次重复测定取平均值，以Vc 做对照。竹笋多糖对ABTS 清除率公式如下：

2.6 数据处理

采用Excel 软件进行数据处理，Origin 2019 软件绘图。所有样品均平行测定3 次，测定结果以平均值表示。

3 结果与分析

3.1 复合酶法提取竹笋多糖工艺条件确定

3.1.1 复合酶配比的确定

3.1.1.1 单因素实验结果

如图1 所示，竹笋多糖提取率在纤维素酶添加量1.5%时出现最高值4.11%。在此之后随着添加量的增加，竹笋多糖提取率反而缓慢降低；图2 显示中性蛋白酶添加量在0.5%～2.5%的范围内时，竹笋多糖得率随着添加量的升高而增加，此后继续增加后多糖得率缓慢下降，最高提取率为4.62%；如图3 所示，果胶酶添加量为1.5%时多糖提取率出现最大值4.07%。之后随着果胶酶量的增加，提取率慢慢降低。原因可能是竹笋多糖主要是由纤维素、果胶和几丁质、半纤维素等成分构成的木素结合层，竹笋多糖存在于紧密的细胞壁内，而不同种类及添加量的酶能使几丁质、半纤维素等与竹笋多糖分离，有助于多糖脱离出来，从而提高了多糖在溶剂中的溶解度[24]。

图1 纤维素酶添加量对提取率的影响

图2 中性蛋白酶添加量对提取率的影响

图3 果胶酶添加量对提取率的影响

3.1.1.2 正交试验结果

复合酶用量正交试验结果与分析从正交试验结果（表3）得出，3 种因素对多糖提取率影响的大小分别为B＞A＞C，即：中性蛋白酶＞纤维素酶＞果胶酶，复合酶最佳酶用量组合为：A2B2C3，即纤维素酶添加量1.5%，中性蛋白酶添加量2%，果胶酶添加量1.5%。以正交设计优化的复合酶用量为参照，经3 组平行试验，验证得竹笋多糖提取率为5.5%，大于复合酶用量单因素考察时，竹笋多糖提取率最大值4.62%。

表3 正交实验设计和结果分析

3.1.2 最优提取条件的确定

3.1.2.1 单因素试验结果

1）料液比对竹笋多糖提取率的影响。如图4所示，料液比逐渐增大时，竹笋提取率先随之逐渐升高后又降低，竹笋多糖提取率最大时为5.48%。随着增大溶剂用量，溶液被稀释导致竹笋的多糖提取率呈降低趋势，所以试验确定1∶20 为竹笋多糖提取的最佳料液比。早期阶段，竹笋多糖的提取率上升可能是由于整个体系的溶剂增多增加了竹笋粉与酶的接触面积，增加了竹笋多糖的浓度迫使更多的多糖被溶出，但料液比达到1∶20 后，溶剂继续增加使得复合酶浓度降低，导致竹笋多糖提取率降低[25]。所以本实验最终选择1:20 的料液比。

图4 料液比对提取率的影响

2）复合酶添加量对竹笋多糖提取率的影响。如图5 所示，结果表明：竹笋多糖提取率随复合酶添加量的增加先升高后降低，复合酶加入量2%时竹笋多糖提取率最高为5.69%。这可能是因为当酶浓度较低时，竹笋的酶水解不足，当酶使用量较高时，竹笋多糖中的一些多糖会被过度分解[26]，使得一些纤维素分解成可溶于水的小分子碎片，导致竹笋多糖提取率下降[27]。所以本实验最终选择1.5%、2%和3%的复合酶用量进行正交试验。

图5 复合酶添加量对提取率的影响

3）pH 对竹笋多糖提取率的影响。结果如图6所示，竹笋多糖提取率随着pH 的增大先升高后，在pH 为4.5 时，酶解效果最佳，此时竹笋多糖提取率为5.12%。这可能是由于pH 影响了酶的可电离基团的电离，从而影响酶与底物的结合，高于或低于最适pH 都会破坏酶的稳定性，影响酶解反应，且这种破坏是不可逆的。所以本实验选择pH=4、4.5、5 进行正交试验。

图6 酶解pH 对多糖提取率的影响

4）提取温度对竹笋多糖提取率的影响。结果如图7 所示，竹笋多糖的提取率在0～50 ℃时逐渐升高，在50 ℃后呈现降低趋势，竹笋多糖的提取率达到峰值，为5.53%，因为当酶解反应的温度小于50 ℃时，酶的活性受到抑制使得竹笋多糖的提取率偏低，在超过酶的最适温度后，酶发生热变性[28]，其空间结构被改变，催化能力也逐渐降低，导致多糖的提取率降低。所以本实验最终选择40、50、60 ℃进行正交试验。

图7 酶解温度对提取率的影响

5）提取时间对竹笋多糖提取率的影响。由图8 可知，竹笋多糖得率在0～2 h 时增加，当酶解时间达到2 h 时，酶与底物充分反应，得到有竹笋多糖最大提取率5.53%，随着酶解时间继续延长，竹笋多糖提取率下降。可能是酶解时间过长，一些小分子量的多糖会附着在大分子蛋白上，在醇沉过程中被除去；同时由于时间延长太多，也可能会造成酶解液被破坏，促使多糖提取率下降[29]。因此，本文最终选择1.5、2、2.5 h 进行正交实验。

图8 酶解时间对提取率的影响

3.1.2.2 提取条件的正交试验结果

根据极差Rj分析结果得出，4 个因素中影响竹笋多糖提取率关系为：提取时间A＞复合酶添加量D＞pHC＞提取温度B。通过正交试验（见表4）得出的结果显示复合酶法提取竹笋多糖最佳工艺条件组合是：A3B2C1D3，在此条件下得到最高竹笋多糖提取率为6.00%。此次正交试验结果所确定的复合酶法提取竹笋多糖的最佳条件：提取时间2.5 h，温度50 ℃，pH 4，复合酶加入量2.5%，料液比1∶ 20。

表4 提取条件正交实验设计和结果分析

3.2 竹笋多糖的抗氧化结果

3.2.1 DPPH 自由基清除能力的测定

由图9 可知，竹笋多糖对DPPH 自由基具有一定的抑制效果，清除自由基的效果随竹笋多糖浓度的增加而逐渐增大，竹笋多糖溶液浓度达到1.5 mg/mL后对DPPH 自由基的清除率呈现平稳的趋势，稳定在30%左右。Vc 的清除率稳定在90%以上，由此可见，与Vc 相比，竹笋多糖对DPPH 自由基的清除率不明显。

图9 对DPPH 自由基清除能力的测定

刘焕燕等[30]研究发现毛竹笋壳的精制多糖溶液对DPPH 自由基具有明显的清除效果，在浓度0.5 mg/mL，精制多糖溶液对DPPH 的清除率已经超过50%，高于本实验数据，原因可能是原料采用的竹笋部位不同；并且本试验所测定的是竹笋提取多糖液，多糖纯度较低。

3.2.2 清除羟基自由基能力的测定

由图10 可知，竹笋多糖质量浓度在0.5～1 mg/mL 之间对羟基自由基清除率稳定增长。当质量浓度在1～1.5 mg/mL 时清除率变化不大稳定在22%左右，当质量浓度在1.5～3 mg/mL 对羟基自由基清除率缓慢上升，并有持续增长的趋势。而Vc 的清除率随质量浓度变化清除率波动不大稳定在82%左右。由此可见竹笋多糖对羟自由基的清除能力较弱。

图10 清除羟基自由基能力的测定

陈莉华等[31]进行了竹笋多糖的体外抗氧化性活性测定试验，结果显示，在一定的浓度范围，竹笋多糖的抗氧化活性与浓度呈现正相关。竹笋多糖对羟基自由基显示出了一定清除抑制效果，最适浓度下竹笋多糖溶液对羟自由基清除率可达到47%，高于本实验测得数据，原因可能是由于该文采用的是超声波辅助水提法并且后续经过醇沉去除了色素和蛋白，所得到的竹笋多糖纯化液中多糖浓度更高。

3.2.3 还原能力的测定

由图11 可知，随竹笋多糖质量浓度的增加，还原能力几乎呈直线上升，当质量浓度到2 mg/mL 后趋于平稳，吸光值稳定在0.38 左右。Vc 的还原能力波动不大，其吸光度值稳定在1.5 左右。王静[32]探究了竹笋多糖还原力能力。结果表明，随着竹笋多糖的增加，其还原力也随之提高，与Vc 相比，虽然还原力较弱，但也有一定的效果。

图11 还原能力的测定

3.2.4 ABTS 自由基清除能力测定

由图12 可知，随着竹笋多糖质量浓度增大时，其对ABTS 自由基的清除效果呈现出明显增强的趋势，对ABTS 自由基的清除率最高接近80%，与Vc 的差距明显缩小，说明竹笋多糖对ABTS 自由基具有很显著的清除效果。

图12 对ABTS 的清除能力的测定l

陈晓燕等[33]测定了竹笋多糖对ABTS 自由基的清除能力，结果显示在竹笋多糖溶液浓度为5 mg/mL 时，竹笋多糖的ABTS 自由基清除率可达86.5%，与本试验结果相符。

4 结论

本实验采用多种酶复合提取竹笋多糖，确定了提取竹笋多糖的复合酶的最佳配比为：纤维素酶添加量1.5%，中性蛋白酶添加量2%，果胶酶添加量1.5%；并通过正交实验优化得到最优提取工艺条件为料液比1∶20、提取时间2.5 h、复合酶添加量为2.5%、pH 为4、温度50 ℃，在此条件下得到最高提取率是6.00%。郑炯等[11]采用超声辅助提取竹笋多糖，多糖得率为2.49%，张帅[12]采用微波-超声波联合辅助提取竹笋多糖，多糖得率为2.76%，相比之下，本实验采用的提取方法提取率分别增加了141%和117%。由此可以验证，本文方法用于提取笋多糖不仅条件温和，提取效果也更佳。在提取时间、提取温度、pH 和酶添加量等因素中，对多糖得率的影响最大的是提取时间，影响最小的是提取温度。研究表明，竹笋多糖有一定的体外抗氧化活性，特别是对ABTS 清除率作用很明显，对DPPH自由基、羟基自由基也有一定的清除能力和还原能力，对未来竹笋多糖在保健品方面的开发具有研究价值。