桔贝合剂质量标准的提升和优化

陈浩 张卫莲 曹蓉蓉 马凤玲

（榆林市药品检验所 陕西榆林 719000）

1 前言

桔贝合剂是一种棕褐色的中药液体口服制剂，主要由7味中药组成，分别为桔梗、浙贝母、苦杏仁、麦冬、黄芩、枇杷叶、甘草；气香、味甜、微苦，具有润肺止咳的疗效，对于肺热咳嗽、咯痰不爽、痰稠色黄等症状具有显著疗效。本品被《卫生部药品标准》中药成方制剂第二册收载记录[1]，标准项目只有性状、检查，但标准较为简单，不利于产品的系统性研究与质量控制。本文通过对桔贝合剂的研究，并结合相关参考文献[2-10]，选用TLC法鉴别制剂中的桔梗、苦杏仁，选用HPLC法测定黄芩中黄芩苷的含量，对质量标准进行系统地研究和探讨，以期为提高桔贝合剂的质量标准提供有效依据。

2 仪器与试药

2.1 仪器

高效液相色谱仪（美国Agilent）；色谱数据工作站（Agilent open LAB CDS chemstation）；紫外检测器（VWD）；十万分之一天平（MS205DU，梅特勒-托利多仪器）；数控超声波清洗器（KQ-500DE，昆山市超声仪器有限公司）。

2.2 试药

黄芩苷对照品（批号：110715-201821）、苦杏仁苷对照品（批号：110820-201808）、桔梗对照药材（批号：121028-201411）（中国食品药品检定研究院）；甲醇（色谱级）；超纯水；硅胶G板（青岛海浪硅胶干燥剂有限公司）；桔贝合剂（10 mL/支，批号分别为：190107、190109、190113，江西诚志永丰药业有限责任公司）；其余试剂均为分析纯。

3 TLC色谱鉴别

3.1 桔梗

取本品20 ml，加入7%硫酸乙醇-水（1∶3）溶液20 mL；加热回流3 h，冷却；加氯仿提取2次，每次使用20 mL；将2次的氯仿溶液合并，再用水洗涤2次，每次使用20 mL，得到的氯仿溶液用1 g无水硫酸钠进行脱水；待氯仿液蒸干，加入1 mL甲醇溶解残渣，制成供试品溶液。另取桔梗的对照药材2 g，加入水-7%硫酸乙醇（3∶1）溶液20 mL，采用相同方法制成对照药材溶液。按处方比例和工艺，取无桔梗的其余药材制成阴性样品，采用相同方法制成阴性对照溶液。按照2015年版的《中国药典》四部TLC法（通则0502）进行试验，取上述3种溶液各6 μL，置于硅胶G薄层板上；展开剂为乙醚-氯仿（1∶2），展开，取出并挥干；喷显色剂为10%的硫酸乙醇溶液；在105℃条件下烘至斑点颜色清晰。在日光下观察，供试品溶液色谱与对照药材溶液色谱相同的位置上，显示出相同的斑点和颜色，表明阴性对照溶液没有干扰，结果见图1。

图1 桔梗TLC色谱图

3.2 苦杏仁

取本品20 mL，浓缩至5 mL；加入甲醇10 mL，超声（180 W，40 kHz）处理30 min；滤过，滤液作为供试品溶液。另取苦杏仁苷对照品5 mg，加入甲醇5 mL溶解，作为对照品溶液。按照处方比例和工艺，取无苦杏仁的其余药材制成阴性样品，采用相同方法制成阴性对照溶液。按照2015年版的《中国药典》四部TLC法（通则0502）试验，取上述3种溶液各10 μL，置于硅胶G薄层板上；展开剂为乙酸乙酯-甲醇-氯仿-水（40∶22∶15∶10）5～10℃的下层液，展开；取出，并立即喷显色剂为0.8%磷钼酸的15%硫酸乙醇溶液；在105℃的条件下烘至斑点颜色清晰。在日光下观察，供试品溶液色谱在与对照品溶液色谱相同的位置上，显示出相同的斑点和颜色，表明阴性对照溶液没有干扰，结果见图2。

图2 苦杏仁TLC色谱图

4 HPLC法测定

4.1 色谱柱

Aglient-5-TC-C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）。分别采用3三种不同的流动相：甲醇-磷酸溶液（45∶55）；甲醇-水-磷酸（47-53-0.2）；甲醇-水-冰醋酸（50∶50∶1）。检测波长分别为：280 nm、278 nm、277 nm、274 nm、315 nm。流速为1.0 mL/min；进样量为10 μL；柱温为30℃。

结果表明，采用波长为280nm，流动相为甲醇-水-磷酸（47-53-0.2）时，峰面积最大，且峰形良好，保留时间合适，基线平稳，更适合定量分析，故本文选择波长280 nm，流动相，甲醇-水-磷酸（47-53-0.2）。

4.2 溶剂的选择

精密量取供试品液体2 mL，转移置50 mL量瓶中，分别加入稀乙醇、70%乙醇、乙醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇、水溶剂各35 mL；超声（180 W，40 kHz）处理30 min，放冷；加入溶剂至刻度，摇匀，即得。

结果表明，用50%甲醇作为溶剂提取时，黄芩苷峰与相邻峰能够完全分离，测定峰面积最大，提取最完全，且分离度符合要求。故本文选择50%甲醇作为提取溶剂。

4.3 处理方法的选择

精密量取供试品液体2 mL，转移至50 mL量瓶中，加入50%甲醇至刻度；精密量取供试品液体2 mL，转移至50 mL量瓶中，加入50%甲醇35 mL，超声5 min，再加入50%甲醇至刻度；精密量取供试品液体2 mL，转移至50 mL量瓶中，加50%甲醇35 mL，超声20 min，再加入50%甲醇至刻度；精密量取供试品液体2 mL，转移至50 mL量瓶中，加入50%甲醇35 mL，超声30 min，再加入50%甲醇至刻度；精密量取供试品液体2 mL，转移至250 mL锥形瓶中，加入50%甲醇50 mL，先称定重量，加热回流提取1 h，放冷，再称定重量，再用50%甲醇补足失去的重量。

结果表明，采用上述5种提取工艺方法进行含量测定，采用50%甲醇超声处理20 min时，黄芩苷已基本提取完全且操作简便，故本文选择桔贝合剂含量的提取方法为超声（180 W，40 kHz）处理20 min。

4.4 溶液的制备

4.4.1 对照品溶液

精密称取黄芩苷的对照品（标示含量为95.4%）27.94 mg，转移至10 mL量瓶中，加入50%甲醇溶解，稀释至刻度，制成对照品溶液，见图3（a）。

4.4.2 供试品溶液

取供试品液体2 mL，转移至50 mL量瓶中；加入50%甲醇35 mL，超声（180 W，40 kHz）处理20 min，放冷；加50%甲醇至刻度，摇匀，制得供试品溶液。见图3（b）。

4.4.3 阴性对照溶液

按照桔贝合剂的制备工艺，制备无黄芩的阴性样品，与供试品溶液的方法处理相同，制得阴性对照溶液，见图3（c）。

图3 HPLC色谱图

5 方法学考察

5.1 线性关系考察

取“4.4.1”中配制的对照品溶液作为对照品初液，逐级稀释成每1ml含106.62、53.31、26.65、13.33、6.66 μg的对照品梯度溶液。分别精密吸取上述溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定出峰面积。以浓度（X，μg/ml）为横坐标，以峰面积（Y）为纵坐标，绘制出标准曲线，得出线性回归方程为Y=36.961X-21.309（r=0.999 9）。试验结果显示，黄芩苷的质量浓度在6.66～106.62 μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。

5.2 精密度试验

取上述同一浓度的对照品溶液，精密量取10 μL；注入液相色谱仪，测定出峰面积；重复进样6次，测得黄芩苷的色谱峰面积RSD为0.15%（n=6），表明仪器的精密度良好。

5.3 重复性试液

取6份样品（批号：190113），同供试品溶液方法制备，进样测定，采用外标法计算供试品含量，测得供试品中黄芩苷的平均含量为1.747 3 mg/mL，RSD=0.29%（n=6），表明该方法的重复性良好。

5.4 稳定性

取供试品溶液（批号：190113），在相同色谱条件下，分别在0、2、4、6、8、12 h进样测定，测得供试品溶液中的黄芩苷色谱峰面积RSD为0.05%（n=6）。结果显示，供试品溶液在12 h内能够保持一定的稳定性。

5.5 加样回收率

精密量取1 mL样品（批号：190113），；加入浓度为2 665.476 μg/mL黄芩苷对照品溶液0.65 mL，按照上述供试品溶液的制备方法，平行制备6份；按照上述色谱条件进行测定，计算回收率，得出平均回收率为98.56%，RSD=0.47%（n=6），结果见表1。

表1 加样回收实验结果

5.6 样品含量测定

取桔贝合剂3批，按“4.4.2”中的方法制备供试品溶液，按照“4.1”中的色谱条件进行测定。3批桔贝合剂测得黄芩苷含量分别为1.918 4、1.885 2、1.747 3 mg/mL（n=3）。

6 讨论

在桔梗、苦杏仁的TCL鉴别中，本文通过改进中国药典2020年版一部[2]的提取方法和展开条件，得到斑点清晰、无杂质干扰、重现性好的薄层色谱图，即阴性对照证实了该方法的可信度。

若炮制或保存黄芩不规范，可使黄芩苷元中的邻三酚羟基被氧化，黄芩苷遭到破坏，质量降低，生成醌类衍生物的颜色由黄色变为绿色[3-4]。因此，在桔贝合剂中，黄芩苷的含量是影响其质量的重要指标。

黄芩苷成分是相对不稳定的化合物，遇到光或热时，容易分解[5]，通过处理方法“4.3”可以验证，加热回流1 h时，测得黄芩苷的峰面积最小，因此在供试品前处理时应缩短受热时间，避免破坏黄芩苷的成分，选用超声处理20 min即可完全提取。因本品中的药品成分较为复杂，使用乙醇、甲醇提取时，黄芩苷峰与杂质的分离不够理想，选用50%的甲醇作为溶剂时，分离度＞1.5，且测得峰面积最大，符合HPLC实验条件，故本文将50%的甲醇作为溶剂，超声处理20 min，确定为供试品溶液的制备方法，并将对照品溶液和供试品液放置于棕色瓶中。

在采用HPLC法测定黄芩苷含量的相关研究中，对黄芩苷的测定波长有280、278、277、274、315 nm，本文对黄芩苷上述5种波长的紫外吸收进行了测验。结果显示，黄芩苷在280 nm处灵敏度和吸收度较高，且色谱峰最满意，故本文选择280 nm作为检测波长。

综上所述，本文建立了TCL鉴别桔贝合剂中桔梗和苦杏仁、HPLC测定桔贝合剂中黄芩苷含量的方法，该方法操作简便、稳定性好、重复性和分离度符合要求，通过多次试验，表明该方法专属性强，具有可行性，能够用于桔贝合剂的质量控制。