双黄连注射剂及参麦注射液类过敏反应的剂量相关性研究

李璎峪，文 雯，刘红宇*，李世雄，赵 靖，李原华，刘文龙

（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 410208；3.中药成药性与制剂制备湖南省重点实验室，湖南 长沙 410208）

有关中药注射剂的不良反应报道显示，过敏样症状发生频率较高，且大多数的中药不良反应/事件尚不明确，这与中药注射剂的多成分、多靶点、多途径有一定的关系，且常用于致敏物质的研究仅局限于单一成分。 中药注射剂是中医药理论与现代工艺技术相结合的产物[1-2]，在急重症等的治疗中发挥了重要作用。 近年来， 随着中药注射剂监管力度的加大、质量要求增高，安全性问题越来越受到重视。 中药注射剂不良反应/事件以类过敏反应为主。类过敏反应的临床症状与过敏反应相似，主要症状为皮肤黏膜红肿、瘙痒、腹痛、恶心、头晕、呼吸困难等，也可致休克或死亡。但这两者的性质及产生机制不同，类过敏反应属于非免疫反应，首次用药30 min 内可通过刺激肥大细胞/嗜碱性粒细胞或补体系统而释放大量组胺，产生过敏样症状[3-8]。 质量控制是中药注射剂安全保障的有效方法之一，常用的药物质量控制方法有代谢组学、一测多评法、指纹图谱法等。 在临床的防治策略及技术上，随着多学科交叉、临床研究、非临床安全性再评价等研究的深入，中药注射剂的整体安全性逐渐提高[9-11]。但在类过敏的防治上还需进一步的发展。

1 材料

1.1 实验动物

清洁级雄性ICR 小鼠，128 只，体质量25～30 g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(湘)2019-0004，于湖南中医药大学实验动物中心屏障环境中饲养，动物伦理编号：201910090002。 小鼠实验期间自由饮水摄食， 温度20～26 ℃，湿度40%～70%。

1.2 药品与试剂

注射用双黄连（冻干）（哈药集团中药二厂，批号：1904002）；参麦注射液（正大青春宝药业有限公司，批号：1912094）；注射用生理盐水（湖南科伦制药有限公司，批号：D20060706）；Compound48/80（美国Sigma-Aldrich 公司，批号：088M4120V）；伊文思蓝（evans blue,EB，上海麦克林生化科技有限公司，批号：C1069175）；丙酮（天津市富宇精细化工有限公司，批号：XK13-011-00034）；小鼠组胺ELISA 试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，批号：DPM78G9DWG）。

1.3 实验仪器

TU-1900 型紫外检测器（北京普析通用仪器有限责任公司）；ME204E/MS205DU 型分析天平[梅特勒托利多科技（中国）有限公司]；H1850R 型台式高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；Multiskan MK3 型多功能酶标仪[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]；5414R 型高速离心机（艾本德中国有限公司）。

2 方法

2.1 药物剂量、浓度

阳性组药物为2.5 mg·mL-1的Compound48/80试液。

注射用双黄连（冻干）成人给药剂量为60 mg·kg-1，按小鼠与人的体表面积换算公式[12]换算得小鼠的给药剂量约为647 mg·kg-1， 即双黄连中组的给药剂量，双黄连低、高组剂量分别为323、1293 mg·kg-1。各组均用生理盐水配制成相同给药体积（10.8 mL·kg-1）的浓度。

参麦注射液成人给药剂量为20～100 mL·d-1，取最小（20 mL·d-1）和最大（100 mL·d-1）及其中间（60 mL·d-1）剂量，按小鼠与人的体表面积换算公式，参麦低、中、高组剂量分别为3.6、10. 8、18.0 mL·kg-1。

2.2 分组及给药

2.2.1 双黄连注射剂及参麦注射液剂量考察分组 64只雄性ICR 小鼠适应性饲养后，随机分组为8 组，每组8 只：对照Ⅰ组，阳性Ⅰ组，双黄连低、中、高组，参麦低、中、高组，以上组别均含0.4% EB。

2.2.2 双黄连注射剂及参麦注射液类过敏反应模型分组 64 只雄性ICR 小鼠适应性饲养后，随机分为4 组：对照Ⅱ组、阳性Ⅱ组、双黄连高组、参麦高组，每组16 只。

2.2.3 给药 用药组小鼠一次性尾静脉注射相应剂量的药物，其中双黄连低、中、高组用生理盐水配制成相同给药体积的浓度（即10.8 mL·kg-1），类过敏模型各组除参麦组外药物均用生理盐水配制成相同给药体积的浓度（即10 mL·kg-1）。

2.3 小鼠类过敏反应模型评价及检测

2.3.1 小鼠类过敏反应行为学评价标准 以小鼠全身类过敏反应症状表现[13]和过敏反应指导原则[14]为标准，观察并记录给药后15 min 内各组小鼠的行为学变化，根据类过敏反应症状分级标准对各组的反应进行评分与分级。根据表现症状进行评分及类过敏程度分级，0 分代表阴性，0～1 分代表弱阳性/疑似类过敏，1～2 分代表阳性，2～3 分代表强阳性，3 分以上代表极强阳性，分数越高对应类过敏反应程度越高。

2.3.2 小鼠耳郭蓝染评价标准 行为学观察结束后，脱颈椎处死各组小鼠并剪下双耳，计算每组小鼠耳郭蓝染反应率，耳郭蓝染反应率=出现耳郭蓝染的动物数/组内动物数×100%。耳郭蓝染面积（S）评分[15]根据小鼠双耳郭蓝染面积所占比例，S=0 分值为0，类过敏反应强度为阴性；0＜S≤1/8 为1 分，类过敏反应强度为疑似类过敏；1/8＜S≤1/4 为2 分，类过敏反应强度为弱阳性；1/4＜S≤1/2 为3 分，类过敏反应强度为阳性；1/2＜S≤3/4 为4 分，类过敏反应强度为强阳性；3/4＜S≤1 为5 分，类过敏反应强度为极强阳性。

2.3.3 小鼠耳郭EB 渗出量 评分后将耳郭剪碎，加丙酮与生理盐水（7∶3）混合液2 mL，至-20 ℃冰箱内浸泡过夜[15]。

取EB 母液，用丙酮与生理盐水（7∶3）混合液稀释 成 浓 度 为0.016 0、0.008 0、0.003 2、0.001 6、0.000 8、0.000 4 mg·mL-1的溶液，将小鼠双耳的丙酮与生理盐水（7∶3）浸液以3000 r·min-1离心15 min（半径3 cm），取上清液，均用紫外分光光度计于610 nm 波长处测吸光度（A），绘制EB 紫外吸收标准曲线并根据标准曲线，计算各组EB 渗出量。

2.3.4 ELISA 法检测小鼠血浆中的组胺 类过敏反应模型组小鼠分别于给药后10、30 min 取血，3000 r·min-1离心15 min（半径3 cm），取上清液待测。按照ELISA试剂盒说明书进行组胺的测定操作。先平衡试剂盒、稀释洗涤液、配制标准品待测；将样品加入标准品中加入孔板中，37 ℃孵育45 min，甩干、洗涤排干重复3 次；在每孔加酶结合物工作液，封板，37 ℃温育30 min，弃液甩干，重复洗板5 次；加底物，封板，37 ℃避光孵育，终止反应；用酶标仪在450 nm 波长处测量各孔的光密度（OD 值）。

2.4 统计学分析

用SPSS 26.0 进行统计分析，服从正态分布者采用单因素方差分析检验，不服从正态分布则采用Kruskal-Wallis 检验，实验结果以“±s”表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组小鼠类过敏反应行为学比较

以全身致敏性反应症状分级标准对各组小鼠计分评级。 给药后，对照Ⅰ组除个别小鼠出现竖毛外，未出现其他明显的异常反应，反应等级均为阴性。阳性Ⅰ组小鼠均以搔鼻、竖毛、自发性活动减少、不安宁、排粪、步态不稳等反应为主，其中有2 例呼吸困难、2 例步态不稳、1 例抽搐反应，有1 例为协同反应。 双黄连低组小鼠以竖毛、搔鼻、排粪等反应为主，3例出现步态不稳等强阳性反应，无死亡；双黄连中组小鼠以不安宁、排粪、排尿反应为主，其中2例出现步态不稳等强阳性反应，无死亡；双黄连高组多表现为竖毛、自发性活动减少且大部分有步态不稳表现，无死亡。 参麦低组部分小鼠有竖毛现象，反应呈阴性；参麦中组部分小鼠有不安宁、竖毛、搔鼻反应，反应级别为阴性；参麦高组小鼠以搔鼻、不安宁、竖毛反应为主，1 例出现步态不稳，反应呈弱阳性。

与对照Ⅰ组相比，阳性Ⅰ组和双黄连低、中、高组及参麦高组行为学评分升高（P＜0.05）；与阳性Ⅰ组比较，参麦低、中组行为学评分降低（P＜0.05）。 详见表1。

表1 各组小鼠行为学评分比较（n=8）

3.2 各组小鼠耳郭蓝染比较

3.2.1 各组小鼠耳郭蓝染评分比较 对照Ⅰ组无蓝染。与对照组Ⅰ相比，阳性Ⅰ组与各药物组的小鼠耳郭出现不同程度蓝染，随着药物组剂量加大，小鼠双耳蓝染面积增大。 详见图1。

图1 各组小鼠类过敏反应耳郭蓝染情况

与对照Ⅰ组相比，阳性Ⅰ组和双黄连低、中、高组及参麦高组耳郭蓝染评分升高（P＜0.05）；与阳性Ⅰ组相比，双黄连高组耳郭蓝染评分升高，参麦低、中组耳郭蓝染评分降低（P＜0.05）。 详见表2。

表2 各组小鼠过敏反应小鼠耳郭蓝染评分（n=8）

3.2.2 各组小鼠耳郭EB 渗出量比较 以EB 浓度为x 轴，测得的吸光度A 为y 轴，绘制EB 标准曲线，得到公式y=66.67 6x+0.000 88，R2=0.999 11。 紫外法检测各组小鼠双耳浸液的吸光度，结合EB 标准曲线，算得EB 渗出量。

与对照Ⅰ组相比，阳性Ⅰ组和双黄连低、中、高组及参麦中、高组的小鼠双耳EB 渗出浓度升高（P＜0.05）；与阳性Ⅰ组比较，双黄连高组EB 渗出浓度升高（P＜0.05）。 详见表3。

表3 小鼠耳郭EB 渗出量比较（n=8）

3.3 各组小鼠组胺浓度比较

运用ELISA Calc 对组胺标准品OD 值进行Logistic 四参数拟合，得方程：y=(2.117 28-0.05 225)/[1+(x/4.912 48)^0.052 25]+0.009 36，R2=0.999 81，说明线性关系好。

结合标准曲线，计算各组血浆样品的组胺浓度。给药后10 min，与对照Ⅱ组比较，阳性Ⅱ组、双黄连高组血浆中组胺浓度升高（P＜0.05）。 与给药10 min后阳性Ⅱ组比较，给药30 min 后阳性Ⅱ组组胺浓度降低（P＜0.05）。 详见图2。

图2 不同反应时间组胺浓度的组间比较（n=8）

4 讨论

本研究以双黄连注射剂及参麦注射液为对象，采用更灵敏且实验易于操作的小鼠类过敏反应模型[5]，以探究中药注射剂给药剂量与类过敏反应发生的关联性，为建立中药注射剂安全性评价提供参考。

双黄连是临床上常用的清热类中药，常见的临床静脉制剂为粉针剂[16-17]。王丽娜[18]关于双黄连注射剂致过敏性休克研究结果显示，66 例不良反应中有58 例为首次给药发生，陈蕾等[19]的双黄连注射剂不良反应调查结果表明，大多不良反应发生在30 min内。 本研究以双黄连注射剂临床剂量（双黄连中组）为中心展开类过敏反应实验，实验结果表明双黄连注射剂剂量越大，致小鼠类过敏程度越高，这一结果与王丽娜[18]报道的超剂量用药产生不良反应相同，双黄连注射剂组胺浓度升高的时间规律与陈蕾等[19]提到的不良反应时间一致。

参麦注射液为治疗心脑血管类疾病的常用中药制剂[20]，临床上使用频率高，在黄济兴等[21]心血管类中药注射剂的合理利用分析报道中，参麦注射液超剂量使用频率占比高。刘雪莹等[22]研究证明，参麦注射液能激活补体系统产生类过敏反应。 这些研究皆说明临床上参麦注射液所致的不良反应/事件大多数为类过敏反应。 本研究中，参麦注射液类过敏模型采用一次性尾静脉注射的方式，给药速度快，与刘青等[23]报道参麦注射液的不良反应/事件与给药速度一致。 参麦低、中、高组的行为学及耳郭蓝染分值逐渐增大，类过敏反应程度逐渐增高，说明超剂量使用参麦注射液可能会导致类过敏反应发生。

综上所述，双黄连注射剂及参麦注射液实验结果表明，随给药剂量增加，类过敏反应等级升高，临床上多因超量使用、滴速过快等不合理用药导致不良反应/事件。双黄连注射剂及参麦注射液的类过敏反应实验对中药注射剂不良反应/事件提供了参考，也为临床上中药注射剂给药剂量及滴速的选择提供了参考和依据。