玉郎伞多糖对S180 荷瘤小鼠氧化应激、免疫调节及血管生成的影响

覃 妮，陆世银，罗文婷，陈家豪，龙嘉怡，黄仁彬*

[1.柳州市中医医院（柳州市壮医医院）药学部，广西 柳州 545026；2.广西医科大学药学院，广西 南宁 530021]

玉朗伞（Yulangsan, YLS）为蝶形花科植物疏叶崖豆[Millettia pulchra Kurz var－laxior (Dunn) Z. Wei]的块根。 玉郎伞多糖(Yulangsan polysaccharides,YLSPS)是从块根中提取的多糖组分，具有祛瘀止痛、消痈排脓、清热解毒等功效[1-2]。 现代药理研究表明，YLSPS 具有提高免疫力、抗肿瘤、抗氧化等多种生物活性[3-4]，其抗肿瘤潜力已得到证实[5-6]。 然而，YLSPS 对肿瘤血管生成的影响及作用机制的相关研究报道较少。肿瘤血管形成是肿瘤增殖、侵袭和迁移的基础，结合YLSPS 具有抗氧化、免疫调节功能的前期研究结果[7-8]，本研究通过建立小鼠S180移植瘤模型，从肿瘤免疫、氧化应激和血管生成的角度探讨YLSPS 的抑瘤作用机制，为其抗肿瘤机制研究提供新的科学依据。

1 材料

1.1 主要仪器

ACB-4A1 型超净工作台（新加坡ESCO 公司）；XS205DU 型电子分析天平（瑞士梅托勒公司）；MULTISKAN MK3 型酶联免疫检测仪、CKX-41 型倒置荧光显微镜（德国奥林巴斯公司）；Micro CL17R型高速低温离心机（美国赛默飞世尔科技公司）；TDL-5A 型台式离心机（上海菲恰尔分析仪器公司）；TU-1800 型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器公司）；4590 型包埋机（日本SAKURA精密技术公司）；RM223 型5 病理组织切片机（德国徕卡公司）；SIM-F140AY65-PC 型颗粒制冰机（日本松下电器）；HH-8 型电热恒温水浴锅（上海汗诺仪器公司）；CD-UPH-II-20L 型超纯水器（成都越纯科技公司）。

1.2 实验动物

SPF 级雌雄各半昆明小鼠，体质量（20±2） g，购自广西医科大学实验动物中心。 动物许可证号：SCXK（桂）2020-0002。

1.3 细胞株

小鼠肉瘤S180细胞株由广西医科大学病理生理学教研室提供，并定期进行腹腔接种传代保株。

1.4 药物与试剂

药品YLSPS（批号：YLS20210312619），由广西医科大学药理教研室提供；注射用环磷酰胺（批号：5J078A），购自德国Baxter Oncology GmbH。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD，批号：20210401）、谷胱甘肽过氧化物（glutathione peroxidase, GSHPX，批号：20210328）活性，丙二醛（malondialdehyde,MDA，批号：20210401）及过氧化氢酶（catalase, CAT，批号：20210330）的含量、考马斯亮兰（批号：20210219）检测试剂盒为南京建成生物工程研究所产品；VEGF ELISA 试剂盒（批号：ab222510）购自欣博盛公司；Anti-CD34 antibody（批号：ab81289），购自美国Abcam 公司。

2 方法

2.1 YLSPS 的制备[9]

将干燥YLS 粉碎后，加8 倍量的纯水煎煮，趁热过滤取滤液，离心取上清液，加入95%乙醇适量与所得上清液混合，使乙醇终浓度为80%，再用无水乙醇、丙酮萃取洗涤5 次，Sevage 法去除蛋白，上清液经透析后浓缩，加5 倍无水乙醇，水溶解后再醇析，重复3 次，直至280、260 nm 波长处无杂蛋白和核酸吸收峰为止，过滤，收集沉淀物，真空干燥得多糖干粉（含生药量26.64 g·g-1）。

2.2 S180 移植瘤模型的建立与给药

将S180细胞在无菌条件下接种于健康小鼠腹腔，待腹水生长旺盛时，抽出乳白色腹水，用生理盐水按1∶10 稀释后以台盼蓝拒染法检测存活率＞90%，细胞计数，调整细胞浓度至1×107·mL-1。 取60只小鼠，每只于右侧腋窝皮下接种0.2 mL 细胞悬液，隔日观察瘤体生长情况，当皮下移植瘤长至直径约5 mm时为造模成功。 将造模成功的小鼠随机分为5组（n=10）：模型组每天灌胃等体积的生理盐水；CTX组为阳性对照腹腔注射环磷酰胺（cyclophosphamide,CTX）20 mg·kg-1·d-1；YLSPS 低、中、高剂量组灌胃给药依次为150、300、600 mg·kg-1·d-1。 连续给药8 d。

2.3 YLSPS 对S180 荷瘤小鼠体质量、脏器指数及肿瘤生长的影响

观察每组小鼠给药后的体质量、活动情况、精神状态、皮毛色泽等。 末次给药24 h 后，称量小鼠体质量，摘眼球取血，颈椎脱臼处死小鼠，解剖取出S180 肉瘤、胸腺、脾脏，用滤纸吸干残血后，分别精确称量并记录，并分别计算抑瘤率与脏器指数（脾脏、胸腺）。 抑瘤率＝（肿瘤模型组的平均瘤重－给药组的平均瘤重）／肿瘤模型组的平均瘤重×100%。 脏器指数＝脏器重量（mg）／体质量（g）。

2.4 YLSPS 对S180 荷瘤小鼠血清生化指标水平的影响

将取得的小鼠血液，室温静置后离心（离心半径10 cm，3500 r/min，15 min）取上清液并按试剂盒说明书操作，对血清中SOD、GSH-PX、CAT、MDA 和VEGF 含量进行检测。

2.5 HE 染色观察YLSPS 对S180 荷瘤小鼠的病理学的改变

取适量肿瘤组织置于10%甲醛固定24 h，经组织脱水、透明，石蜡包埋制片，3 μm 连续切片以二甲苯脱蜡，梯度乙醇浸泡水化后，浸泡于水中，然后进行HE 染色。在光学显微镜下观察、比较肿瘤细胞的形态变化。

2.6 免疫组化法检测YLSPS 对S180 荷瘤小鼠瘤组织内微血管密度的影响

肿瘤组织切片经脱蜡、抗原修复后，按免疫组化试剂盒说明书分别滴加CD34 鼠抗单克隆抗体和二抗，DAB 显色，苏木素复染，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片、镜下观察。 CD34 阳性血管内皮细胞被染成棕色或棕黄色，相互分离的内皮细胞且无显著管腔或由内皮细胞形成管腔，当管腔小于8个红细胞面积者即为微血管，先低倍光镜下（100×）选择微血管密集的肿瘤区域，然后通过高倍镜下（400×）随机计数3 个视野内所有染色的微血管数，平均值作为微血管密度（microvessel density, MVD）。

2.7 数据统计与分析

采用SPSS 20.0 软件进行数据统计学分析，所有资料均作正态性检验和方差齐性检验，实验数据以“±s”表示，用单因素方差分析结果。 多组间比较采用方差分析，P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 YLSPS 对S180 荷瘤小鼠生长状态与肿瘤抑制的影响

各组小鼠接种S180细胞后1 周肿瘤直径约为5 mm，小鼠精神萎靡，行动迟缓，毛发干枯蓬松，肿瘤生长迅速，各给药组有不同程度的缓解。如表1 所示，CTX 组抑瘤率为73.83%，YLSPS 低、中、高剂量组的抑瘤率分别为34.75%、47.46%和58.78%。 与模型组比较，各给药组均可显著抑制肿瘤生长（P＜0.001）。此外，CTX 组荷瘤小鼠胸腺指数、脾脏指数明显下降，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.001）。YLSPS 各剂量组荷瘤小鼠胸腺指数、脾脏指数与模型组比较均具有增高的趋势，且高、中剂量组尤为显著（P＜0.05，P＜0.001）。 详见表1。

表1 YLSPS 对S180 荷瘤小鼠体质量及肿瘤抑制、脾脏指数、胸腺指数的影响（±s，n=10）

表1 YLSPS 对S180 荷瘤小鼠体质量及肿瘤抑制、脾脏指数、胸腺指数的影响（±s，n=10）

注：与模型组比较，*P＜0.05，***P＜0.001。

组别模型组CTX 组YLSPS 低剂量YLSPS 中剂量YLSPS 高剂量体质量/g 27.78±0.78 27.09±1.11 26.28±1.03 26.77±0.89 28.52±0.93胸腺指数/（mg·g-1）2.92±0.32 0.97±0.25***2.99±0.55 3.21±0.78*3.63±0.45***脾脏指数/（mg·g-1）4.78±0.56 2.95±0.49***4.87±0.74 5.11±0.55*5.70±0.37***瘤重/g 1.51±0.45 0.39±0.09***0.98±0.16***0.79±0.22***0.67±0.16***抑瘤率/%—73.83 34.75 47.46 58.78

3.2 YLSPS 对S180 荷瘤小鼠血清生化指标水平的影响

与模型组比较，YLSPS 各剂量组小鼠血清SOD活性显著升高（P＜0.05，P＜0.001），YLSPS 低剂量组有提高GSH-Px、CAT 活性的趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05），而中、高剂量组GSH-Px、CAT 活性明显增强，差异具有统计学意义（P＜0.05，P＜0.001）。相较于模型组，YLSPS 中、高剂量组中MDA 含量显著降低（P＜0.05，P＜0.001）。与模型组比较，CTX 组小鼠血清SOD 活性升高（P＜0.05），而GSH-Px、CAT 活性呈现明显下调趋势，MDA 水平显著升高（P＜0.05，P＜0.001）。 详见表2。

表2 YLSPS 对S180 荷瘤小鼠血清GSH-Px、CAT、SOD、MDA 水平的影响（±s，n=10）

表2 YLSPS 对S180 荷瘤小鼠血清GSH-Px、CAT、SOD、MDA 水平的影响（±s，n=10）

注：与模型组比较，*P＜0.05,***P＜0.001。

组别模型组CTX 组YLSPS 低剂量YLSPS 中剂量YLSPS 高剂量MDA/（nmol·mL-1）5.64±0.49 6.78±0.52***5.49±0.79 5.26±0.63*4.92±0.63***SOD/（U·mL-1）198.17±9.56 208.55±7.79*208.25±9.64*211.12±9.28***213.35±8.60***GSH-Px/（U·mL-1）721.01±11.24 633.85±12.26***734.88±13.03 746.97±21.78*791.54±16.01***CAT/（U·mg-1）369.69±22.81 341.28±14.08*378.34±16.61 424.77±16.46***517.39±13.15***

3.3 YLSPS 对S180 荷瘤小鼠肿瘤组织病理学的影响

模型组中肿瘤细胞丰富且紊乱分布，细胞结构、形态完整且大小不一，瘤细胞异型性明显，呈现病理性核分裂现象。 经药物干预后，各给药组肿瘤细胞及细胞染色质皱缩，异型性降低，病理性核分裂减少，可见散在的与融合成片状的坏死灶。详见图1A。

3.4 YLSPS 对S180 荷瘤小鼠移植瘤MVD 的影响

模型组肿瘤组织内CD34 阳性染色的微血管数量众多，而经药物干预后，CTX 组、YLSPS 不同剂量组肿瘤组织内CD34 阳性染色的微血管数量较模型组均显著减少（P＜0.001），提示YLSPS 可减少实体瘤组织MVD，且YLSPS 对MVD抑制作用强度呈剂量依赖性，高剂量组与CTX 组作用相当。 如表3所示，与模型组相比，CTX 组对VEGF 表达具有显著抑制作用（P＜0.001），而YLSPS 低剂量组有下调VEGF 表达的趋势，但差异化未达到显著水平，差异无统计学意义（P＞0.05），YLSPS中、高剂量组对VEGF 表达有明显的抑制作用，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.001）。 详见表3 和图1B。

图1 YLSPS 对S180 荷瘤小鼠肿瘤组织病理学与微血管数量的影响

表3 YLSPS 对S180 荷瘤小鼠VEGF 表达和MVD 的影响（±s，n=10）

表3 YLSPS 对S180 荷瘤小鼠VEGF 表达和MVD 的影响（±s，n=10）

注：与模型组比较，*P＜0.05,***P＜0.001。

组别模型组CTX 组YLSPS 低剂量YLSPS 中剂量YLSPS 高剂量MVD/（CD34）43.02±7.19 16.82±3.52***37.10±6.23***21.14±5.81***19.98±5.21***VEGF/(pg·mL-1)21.02±1.13 8.82±0.51***20.10±0.93 18.14±0.85*16.98±0.98***

4 讨论

在复杂的循环与代谢中，多糖承担着能量储存与来源或结构材料的角色，参与细胞的转化和凋亡、免疫功能调节、抗氧化、细胞间物质运输与信号传导等生物过程，发挥重要的生理功能作用[10]。当多糖类与免疫细胞的表面多糖受体结合时，可激活细胞的信号转导途径，促使巨噬细胞产生细胞因子，进而诱导和调控免疫反应、抑制肿瘤或癌细胞的生长增殖[11-12]。 YLSPS 可通过抑制肿瘤细胞增殖、侵袭、转移、诱导肿瘤细胞凋亡等途径发挥抗肿瘤作用[5]。本研究利用小鼠S180移植瘤模型探讨YLSPS对荷瘤小鼠的抑瘤作用，证实了YLSPS 具有较好的抑制S180荷瘤小鼠肿瘤生长的作用，展现了较好的应用前景。

机体免疫功能的下降会加剧肿瘤的发生和发展，而肿瘤的出现也往往导致机体免疫器官的萎缩和免疫能力的衰弱[13]。其中，胸腺和脾脏是机体重要的免疫器官，其指数可在一定程度上衡量机体的免疫水平[14]。本实验结果显示，经YLSPS 干预后S180荷瘤小鼠脾脏指数和胸腺指数均具有不同程度地回升，呈现剂量依赖性，表明YLSPS 具有改善荷瘤小鼠脾脏和胸腺损伤的作用，提示YLSPS 可能通过提升机体免疫功能发挥抗肿瘤作用。

氧化应激与肿瘤的发生发展密切相关，当机体微环境处于氧化应激状态时，体内自由基代谢紊乱，基因转录、细胞信号转导、酶和生物大分子活性及细胞的增殖、分化、凋亡等生理功能异常，最终导致肿瘤[15]。 植物多糖具有直接清除活性氧和提高抗氧化酶活性的作用，从而发挥抗氧化功效[16]。SOD 作为一种过氧化物分解酶，是机体关键的抗氧化防御物质，体内自由基清除速率随着SOD 活性的升高而加快。GSH-Px 是体内常见的重要催化氧化酶之一，通过其还原过氧化物的作用，从而阻断了脂质过氧化的链式反应。 当机体发生氧化应激时，部分脂肪酸会氧化分解为一系列复杂的化合物，其中就包括MDA，此时体内的MDA 水平显示了脂质过氧化水平。 正常生理状况下机体拥有由GSH-Px、CAT、SOD等抗氧化物酶构成的一套完整的抗氧化防御体系，它们在体内保持动态平衡[17]，而当抗氧化防御体系失衡出现异常时，致使MDA 等脂质过氧化产物大量生成并累积，随后造成细胞的氧化损伤，最终导致肿瘤的发生与发展[18]。本研究表明，YLSPS 治疗后能明显上调S180荷瘤小鼠血清中GSH-Px、CAT 和SOD 水平，下调MDA 水平。说明YLSPS 可通过提高S180荷瘤小鼠抗氧化酶活性、抑制脂质过氧化反应和清除自由基等方式抑制荷瘤小鼠机体内氧化应激，进而抑制肿瘤生长。提示YLSPS 能通过抑制氧化应激发挥其抗肿瘤作用。

前期研究发现，YLSPS 可抗血管生成[5]，故推测YLSPS 可能通过抑制血管生成发挥抗肿瘤作用。MVD 是当前公认评价肿瘤血管生成程度的重要指标，可通过检测MVD 探讨药物对肿瘤血管生成的调控作用[19]。 本实验以免疫组化法测定小鼠肿瘤组织血管内皮细胞CD34 的阳性水平，计算微血管密度，结果表明YLSPS 各剂量组均能显著降低实体瘤组织的MVD，从而抑制S180荷瘤血管的生成。 此外，VEGF 为至今公认作用最强、专属性最好的促血管内皮细胞增殖和促血管生成因子，其表达水平高低可衡量血管形成能力的大小，在实体瘤血管新生过程中具有举足轻重的作用[20]。研究证实，体内肿瘤由于微环境的变化与癌基因的激活表达促使肿瘤细胞大量生成VEGF[21]。VEGF 对肿瘤血管内皮细胞上的VEGF 受体具有高度选择性，从而介导内皮细胞增殖、分裂、迁移；其次可提高微小血管的通透性，致使血浆大分子外渗沉积在血管外的基质中，加速了肿瘤细胞的生长和新生血管网的形成，同时也为肿瘤细胞的远处侵袭提供通道[22]。 新生血管促进肿瘤持续发展，而肿瘤发展又诱导VEGF 快速大量累积，使肿瘤发展形成一种恶性循环。因此，针对VEGF 及其受体的靶向干预手段可改善肿瘤内新生血管生成，有助于抑制肿瘤的生长、侵袭和扩散。 本研究通过ELISA 法检测了S180荷瘤小鼠肿瘤组织中VEGF 蛋白的表达，结果表明YLSPS 中、高剂量可显著抑制VEGF 蛋白的表达。

综上所述，YLSPS 具有调节小鼠免疫功能、抑制氧化应激及抗S180荷瘤小鼠肿瘤生长的作用，并能降低肿瘤组织中VEGF 的表达及MVD，提示YLSPS抗肿瘤机制与改善免疫功能、抗氧化及抑制肿瘤血管的生成有关。