基于UPLC-Q-TOF/MS 技术分析妇科千金胶囊化学成分

廖颖妍，汪宇馨，秦思雨，夏伯候*

（1.湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学湘产大宗药材品质评价湖南省重点实验室，湖南 长沙 410208）

妇科千金胶囊由千斤拔、穿心莲、金樱根、鸡血藤、党参、功劳木、单面针、当归8 味中药材组成，临床常用于治疗急、慢性妇科炎症，气滞血瘀型原发性痛经，慢性淋病等，总方具有清热祛湿、活血解毒、益气补血的功效。 妇科千金方或胶囊的原药材质量控制研究较丰富，方中单味药材大多通过高效液相色谱法或薄层色谱法建立其指纹图谱对其进行品质评价和质量研究，但是对于妇科千金胶囊成药的质量控制研究手段比较欠缺，王康华等[1]首次建立了妇科千金胶囊HPLC 特征图谱；MA 等[2]首次采用UPLC建立了20 批妇科千金胶囊的指纹图谱， 并基于COX-2建立了抗炎生物活性测定方法；刘晓艳等[3]利用SPMEGC/MS 检测了不同批次妇科千金片/胶囊中当归的差异性挥发性成分，并进行了定性和半定量分析。通过查阅文献发现，目前多用高效液相色谱法检定其有效成分及相关含量，或者是用SPME-GC/MS 技术分析其挥发性成分[3]，但利用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱联用技术对其成分的分析和鉴定暂无报道。目前，《中华人民共和国药典》中对妇科千金胶囊的质量标准控制是选择穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量作为指标，而药品中其他成分的含量并没有建立质量标准。 全方位检测药物中主要化学成分对于进一步研究其药效物质基础及质量控制甚为重要。 妇科千金胶囊作为中药大品种，其质量控制如果能够跟临床功效和作用机制联动，对提升中药复方制剂的品质大有裨益。 因此，本文采用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱联用技术技术对妇科千金胶囊进行快速而全面的成分分析，根据化学成分的质谱信息与数据库、对照品、相关文献等比对，鉴定其结构，为该药的药效机制研究提供科学依据。

1 仪器与材料

超高效液相色谱串联四级杆/飞行时间质谱（安捷伦公司）；QUINTIX224-1/10 型万之一电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；Mini-Q-Intergral 型纯水机（美国Millipore 公司）；2K15 型低温超速离心机（德国Sigma 公司）。质谱级乙腈（德国Merck 公司产品，批号：11052429939）；色谱级甲酸（美国Fisher Scientific 公司，批号：UN1779）；小檗碱（批号：DST191113-009，质量分数98%）、染料木苷（批号：DST200319-003，质量分数98%）、染料木素（批号：DST190915-002，质量分数98%）、芦丁（DSTDL-001701，质量分数98%）均购自成都乐美天医药科技有限公司；原儿茶酸（批号：YZ112420，质量分数98%）、蒿本内酯（批号：YZ060122，质量分数98%）购自南京源植生物科技有限公司；党参炔苷（批号：PCS0288-210324，质量分数 98%）、脱水穿心莲内酯（批号：PCS0183-201210，质量分数98%）购自成都植标化纯生物技术有限公司；木兰花碱（批号：M-026-170612，质量分数98%）购自成都瑞芬思生物科技有限公司；穿心莲内酯（批号：110797-201103，质量分数98.7%）购自中国食品药品检定研究院。妇科千金胶囊（规格0.4 g/粒，批号20201109）来自株洲千金药业股份有限公司。

2 实验方法

2.1 色谱条件

色谱柱：KROMASIL 100-5-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）， 流动相0.1%甲酸水 （A）-乙腈（B），流速0.3 mL/min，进样量1 μL，柱温30 ℃，梯度洗脱程序：0～15 min，15%～35% B；15～20 min，35%～70% B；20～25 min，70% B；25～27 min，70%～100% B，27～30min：100%～15%B。紫外检测器：双波长模式，信号A、B 的波长分别为：254、320 nm；检测时间：30 min。

2.2 质谱条件

电喷雾离子化源，正、负离子检测模式。 毛细管电压为正离子3000 V，负离子3500 V，喷嘴电压1000 V，锥孔电压65 V，碎裂电压175 V，雾化器温度320 ℃，雾化器气流8 L/min，分子量扫描范围为m/z 100～1100，碰撞能量梯度10、40 eV，鞘气温度350 ℃。

2.3 供试品及对照品溶液的配制

2.3.1 混合对照品溶液 精确称取对照品木兰花碱、小檗碱、穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯、染料木苷、染料木素、芦丁、原儿茶酸、党参炔苷、蒿本内酯于25 mL 容量瓶，用70%甲醇溶解定容，摇匀后备用。取一定量的上述对照品储备液进行稀释，制备混合对照品溶液，使各对照品浓度分别为：0.320 0、0.153 6、7.680 0、8.000 0、0.076 8、0.012 0、0.160 0、0.004 0、0.002 0、0.160 0 μg/mL，精密移取1 mL 混合对照品溶液，15 000 r·min-1的速度离心15 min （离心半径：12 cm）取上清液，待测。

2.3.2 妇科千金胶囊试品的处理 精密称取0.051 2 g 试品置于20 mL 锥形瓶内，用70%甲醇溶解，25 ℃超声30 min。冷却至室温后定容并摇匀，15 000 r·min-1的速度离心15 min（离心半径：12 cm），取上清液，待测。

2.4 物质鉴定

通过查阅文献、对照品检测，同时结合安捷伦中药化合物数据库，建立妇科千金胶囊化学成分数据库，并使用MassHunter Qualitative Analysis 软件解析各色谱峰的精确质量数、分子式、特征碎片离子，按照筛选规则为：质量数误差≤5 mDa，质量测量准确度≤5×10-4，保留时间误差≤0.1 s，找到源内碎片优先，同时通过与部分对照品及相关文献比对后，人工筛选分析妇科千金胶囊中化学成分。

3 结果与分析

3.1 供试品溶液总离子流图

精确称取样品粉末0.051 2 g 置于20 mL 锥形瓶内，用70%甲醇溶解，25 ℃超声30 min。冷却至室温后定容并摇匀，15 000 r·min-1的速度离心15 min取上清液，注入1 μL，按照“2.1、2.2”项下条件进行实验。混合对照品溶液基础峰强度（BPI）。详见图1。

图1 样品正离子模式（A）和负离子模式（B）下的离子流图

3.2 色谱峰中主要化学成分的鉴定

根据化学成分数据库并结合相关文献最终从妇科千金胶囊中鉴定出31 个化合物，具体信息见表1。

表1 妇科千金胶囊中化学成分的UPLC-Q-TOF/MSE 鉴定结果

续表1

3.3 生物碱类

生物碱类成分在ESI 正离子检测模式下有良好的响应。 一共检测出10 个生物碱类化合物成分，分别为化合物4、7、8、12、13、14、15、18、20、25。 通过与对照品和文献资料进行对比，分别鉴定为木兰花碱、木兰剑毒碱、白鲜碱、非洲防己碱、药根碱、异粉防己碱、小檗碱、两面针碱、茵芋碱、巴马汀，主要来自药材单面针和功劳木。 峰号8 的化合物正离子模式下测得一级质谱准分子离子峰m/z 200.070 2[M+H]+，其二级碎片离子数据m/z 14.064 7[M+H-C2HO2]+，结合文献鉴定化合物为白鲜碱。 对化合物14 进行分析：测得正离子模式下一级质谱准分子离子峰m/z 623.308 9[M+H]+，其二级碎片离子峰m/z 592.273 4[M+H-OMe]+、580.257 2[M+H-OMe-C]+。 当分子中存在杂原子时，裂解常发生于杂原子邻近的碳碳键上，据文献[12]对其裂解模式进行推测，鉴定为异粉防己碱，裂解途径见如图2。

图2 异粉防己碱的质谱裂解途径

3.4 萜类

共检测出7 个萜类化合物，分别为峰号为5、11、16、17、19、21、23 的化合物。 分别解析为穿心莲内酯、12,13-双氢穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯、7-羟基脱水穿心莲内酯、脱氧穿心莲内酯、新穿心莲内酯、3-去氧脱水穿心莲内酯。 均来源于药材穿心莲。化合物19 的准分子离子峰m/z 为335.220 7 [M+H]+，进一步破碎得到的二级碎片离子m/z 317.201 7、299.194 8、287.199 8，结合解析软件的解析结果，对比化合物库中脱氧穿心莲内酯的二级碎片离子m/z 317.2017 [M+H-H2O]+、299.194 8[M+H-2H2O]+，鉴定化合物为脱氧穿心莲内酯。

以化合物5 为例，对其进行文献对比和解析，扫描正离子模式的一级质谱图得到准分子离子峰：m/z 351.215 8[M+H]+，其二级质谱碎片离子数据分别为：m/z 333.206 6 [M+H-H2O]+、315.191 7 [M+H-2H2O]+、297.185 1 [M+H-3H2O]+、285.182 9 [M+H-2H2O-CH2O]+、257.151 6[M+H-2H2O-CH2O-CO]+，鉴定为穿心莲内酯。化合物裂解时，羧基与碳原子以双键形式相连的氧原子电负性较强，容易得到质子进行下一步裂解。由此对峰号5 裂解模式进行推测，鉴定为穿心莲内酯，其裂解途径推测见图3。

图3 穿心莲内酯的质谱裂解途径

3.5 苯酞类

通过对照品确证和参考文献比对， 鉴定出3 个苯酞类化合物。 化合物28，通过标准品比对鉴定其为藁本内酯，来源于当归。峰号为27 的化合物在正离子模式下准分子离子峰m/z 为191.105 9 [M+H]+，其二级质谱碎片离子峰m/z 为116.060 9、77.038 2。对比文献中的3-丁基苯酞正离子模式下的准分子离子峰，鉴定峰号27 的化合物为3-丁基苯酞，来源于组分当归。 对峰号为26 的化合物进行解析，扫描正离子模式的一级质谱图得到准分子离子峰：m/z 189.090 5 [M+H]+，其二级质谱碎片离子数据为m/z 128.061 8[M+H-C2H4O2]+，鉴定为丁烯基酞内酯。 由于酯类结构容易进行水解得到R-COO-结构，氧具有较强的负电性，从而引发临近碳碳双键结构上的电子转移，对峰号26 裂解模式进行推测，鉴定为丁烯基酞内酯，其裂解途径推测见图4。

图4 丁烯基酞内酯的质谱裂解途径

3.6 黄酮类

检测出峰号为3、6、9、22、24、31、34、35 的化合物为黄酮类化合物。 对峰号3 的化合物，一级质谱图准分子离子峰数据：m/z 291.086[M+H]+，其二级碎片离子为m/z:139.038 6 [M+H-C8H8O3]+，对照文献与质谱数据，对峰号3 裂解模式进行推测，鉴定为（-）-儿茶素，其裂解途径推测见图5。

图5 （-）-儿茶素的质谱裂解途径

对峰号9 的化合物， 其一级质谱图准分子离子峰数据：m/z 271.059 4 [M+H]+，其二级质谱碎片离子峰：m/z 153.013 [M+H-C8H6O]+、m/z 91.054 0 [M+H-C8H6O-H2O]+。对峰号24 的化合物进行分析，其一级质谱准分子离子m/z 为423.178 4 [M+H]+，二级碎片离子数据为m/z 404.348 9，解析为Flemichin D；通过对照标准品、软件解析数据与文献资料，峰号31 的化合物解析为（+）-儿茶素。 峰号34 的化合物一级质谱准分子离子m/z 为269.045 1[M+H]+，二级碎片离子数据为m/z 151.000 0、m/z 117.034 6，解析为芹菜素；峰号35 的化合物一级质谱准分子离子m/z 285.040 0[M+H]+，二级碎片离子数据为m/z 93.151 4，解析为山柰酚。 8 个化合物主要来自金樱根、千斤拔、鸡血藤、单面针、党参。

3.7 有机酸类

共检测出6 个有机酸类化合物，分别是峰号1、2、29、30、32、33 的化合物。对照标准品与文献数据，解析化合物分别为烟酸、绿原酸[21]、原儿茶酸、咖啡酸、阿魏酸、壬二酸，分别来自于药材党参、穿心莲、鸡血藤、穿心莲、当归、党参。

对峰号2 进行解析，通过一级质谱图分析得准分子离子峰为m/z 355.101 3[M+H]+，其二级碎片离子为m/z 312.082 4 [M+H-C2H2O]+、m/z 163.037 3[M+H-C2H2O-C5H9O5]+，通过对比文献与标准品数据，鉴定其为绿原酸。 对于酸的裂解，其裂解机制与酯相似，羧基中与碳相连的氧原子易受到轰击与质子结合引发电子重新排布从而裂解。 对峰号2 裂解模式进行推测，鉴定为绿原酸，其裂解途径推测见图6。

图6 绿原酸质谱裂解途径

3.8 苷类 检测得峰号10 的化合物负离子模式下准分子离子峰m/z 441.175 7[M+COO]-，其二级碎片离子m/z 305.124 1、215.108 0、185.095 9、179.055 1；对比标准品，鉴定其为党参炔苷，来源于党参。

4 结果与讨论

妇科千金胶囊属于国家保护中药，也是最早一批收载入国家基本药物管理的中成药，具有清热除湿、活血解毒、益气补血等功效。 总方包含千金拔、穿心莲、金樱根、鸡血藤、党参、功劳木、单面针、当归8 味中药材，由于成分复杂，以往研究主要是指纹图谱或者少数指标性成分的定性定量分析，不足以更好地体现中药复方制剂的整体质量。 本研究采用UPLC-Q-TOF/MS 技术，并结合在线数据库和文献以及标准品对妇科千金胶囊中化学成分进行分析鉴定，通过ESI 正负离子两种模式，从妇科千金胶囊中初步鉴定出35 个化合物，其中生物碱类10 个，包括：木兰花碱、木兰剑毒碱、白鲜碱、非洲防己碱、药根碱、异粉防己碱、小檗碱、两面针碱、茵芋碱、巴马汀。 黄酮类化合物8 个，分别为（-）-儿茶素、大豆苷、染料木素、芒柄花素、Flemichin D、（+）-儿茶素、芹菜素、山柰酚。 萜类7 个，分别为穿心莲内酯、12,13-双氢穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯、7-羟基脱水穿心莲内酯、脱氧穿心莲内酯、新穿心莲内酯、3-去氧脱水穿心莲内酯。 有机酸类化合物6 个，分别为烟酸、绿原酸、阿魏酸、原儿茶酸、咖啡酸、壬二酸。苯酞类化合物3 个，丁烯基酞苯内酯、3-丁基苯酞、藁本内酯，糖苷类1 个为党参炔苷。 生物碱类成分主要来自单面针和功劳木，萜类成分主要来自穿心莲，黄酮类成分来自党参、千斤拔、单面针、鸡血藤和金樱根，其中，木兰花碱、木兰箭毒碱、药根碱、脱水穿心莲内酯、脱氧穿心莲内酯、茵芋碱、芒柄花素和巴马汀的响应值很高，为后续进行质量标志物的研究以及为药材的配伍规律研究提供了依据。 通过利用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱联用技术对妇科千金胶囊的化学成分进行分析可为深入研究妇科千金胶囊的药效物质基础和基于质量标志物的质量控制升级提供参考。