动物模型在中医眼科研究中的应用思考

梁丽娜，李晓宇

疾病动物模型，简而言之是指具有人类疾病模拟性表现的实验动物。在人类医学漫长曲折的发展历程中，实验动物做出了不可磨灭的贡献。巴浦洛夫在犬身上发现的条件反射奠定了人们对大脑认知行为研究的基础，HANS SELYE 通过一系列的动物有害刺激实验创立了“应激学说”，小鼠组织相容性抗原实验对输血及器官移植产生了巨大推动作用[1]。目前，动物模型已广泛应用于生命科学、医学、食品安全和军事医学等领域的探索，以及生物医药和健康产品的研发[2]。在Pubmed 网站（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）上检索近30 年的科研论文中约有2,000 多万篇是建立于动物模型的研究上，几乎涵盖生命科学与医学的所有领域，实验动物已成为医药科技创新发展的重要工具[3]。

随着中医药现代化研究的不断深入，中医学研究已经不再局限于经典校注、理论思辨和临床观察为主的传统模式，设计良好的动物实验和临床试验已成为中医科研体系的重要组成部分[4]。20世纪60年代，邝安堃教授首次研制出中医阳虚证动物模型，拉开证候动物模型研究的序幕，其后学者们经过不断地努力及尝试，逐步将气血津液辨证、八纲辨证、脏腑辨证、六经辨证等融入动物模型的建立，使中医证候动物模型得到了很大的充实和发展[5]。现已有百余种可以复制的证候动物模型，并且部分与西医疾病模型相结合，建立了更加符合中医临床实践的病证结合模型。中医眼科是中医学的重要分支，动物模型对中医眼科的研究和发展有何意义？目前用于中医眼科研究的动物模型现状如何？如何建立具有中医眼科特色的动物模型？笔者就上述问题进行了梳理和思考，与大家分享讨论，期望对今后相关领域的研究有所借鉴和帮助。

1 动物模型对中医眼科研究的意义

1.1 推动中医眼科传承和发展

纵观中医发展史，医者主要是通过临床观察来认识疾病的发生、发展及变化规律，并从中总结有效的防治方法。源于实践是中医最大的特征，但历史证明，仅仅局限于临床观察的研究方法亦制约了其本身的发展。五轮学说、八廓学说、肝窍学说、玄府学说是中医眼科传统理论的支柱，在临床实践中发挥了重要的指导作用。但由于部分学说的内容笼统而抽象，缺乏坚实的客观依据支撑，已逐渐失去实际的指导意义。相比较而言，玄府学说在中医眼科的应用得到越来越多的关注[6-8]，且该学说的研究在其他专业领域也有诸多报道，人们发现“开通玄府”治疗可减轻大鼠脑出血模型血脑屏障损害，降低其通透性，改善脑水肿，促进神经功能恢复，且这种调节作用呈双向性[9]；另有动物实验显示“利水开玄”治法可以改善中风急性期缺血再灌注损伤，减轻脑水肿的发生[10]。这些借助于动物模型对玄府实质的研究探讨，在一定程度上阐释了该理论的内涵，也将促进玄府学说在眼科的应用和发展。

1.2 加速中医眼科新药的研发

人与动物之间的差异性不只表现在生理、病理方面，还有心理和社会环境的差异，而这些差异性有时会导致在药物研发过程中出现“动物点头人不点头，人点头动物不点头”的现象[11]。2021 年由国务院颁布印发《“十四五”市场监管现代化规划》中指出要建立中医药理论、人用经验、临床试验相结合的中药特色审评证据体系[12]。但这不意味着中医药研究不需要动物实验，对绝大多数创新药物来讲，动物实验是必经之路，也是一条捷径。例如药物的安全性评价，既往有“神农尝百草，一日而遇七十毒”的记载，现在可以通过动物实验预测中药的不良反应，而不是通过漫长的人用经验总结。另外，借助于动物模型的药理学研究则为新药的研发奠定了重要的前期基础。青蒿抗疟疾源自临床实践，而特效抗疟疾新药青蒿素的作用则首先在细胞及动物实验中得到证实；黄连素在临床的广泛应用亦离不开动物实验的证据支持；而天然抗癌药紫杉醇的发现则完全起于细胞实验和动物实验的筛选和证实。

1.3 促进人们对中医眼科的理解、接受和应用

临床疗效是中医赖以生存的基石，但有时会被错误地认为是“贪天之功”或者是“信则灵”的安慰剂作用，这种局面的形成，一方面因中医药疗效很难用目前现代医学公认的方法进行全面评价，另一方面也与作用机制未予明确阐释有关，一旦“知其然，又知其所以然”，人们对中医药的理解与信任度会有明显的提升。笔者曾受邀在美国加州大学洛杉矶分院Jules Stein 眼科研究所做“中医治疗疑难性眼病”报告，会后收到很多眼科专家的邀请期望进一步合作；也曾在挪威“St Olav Clinic”针灸诊所做中医治疗眼病的专题讲座，参加人员除针灸执业医师外，还有当地的眼科医生、视光学医师。回国后不久就收到来自诊所的好消息：参会的眼科医生及视光学医师开始给诊所推荐患者，而之前多是斥责他们为什么给患者实施没有证据的治疗。人们的态度由排斥转为认可，其原因是由于对中医药的作用及机制有了认识，这些认识不能只建立在中医理论的自圆其说，也要有现代研究提供的理论支撑。

2 中医眼科动物模型现状

2.1 模型动物的选择

目前用于眼科疾病研究的实验动物主要有小鼠、大鼠、家兔、豚鼠、小型猪、斑马鱼以及灵长目动物恒河猴、猕猴等，选择何种动物进行实验取决于所研究疾病的种类及实验条件。比如：大、小鼠与人类生理特性有相似性，体型小易控制，而且研究背景资料丰富，被用于多种眼病的研究。但由于小鼠眼球很小，眼轴测量困难，而且无调节功能，故限制了其在近视研究中的应用；同为哺乳动物的豚鼠眼球结构和人类很相似，巩膜组织在近视发生发展过程中出现细胞外基质降解，因此被近视研究人员所青睐[13]；家兔眼球较大，易于眼部的观察及操作，多应用于角膜疾病的研究；斑马鱼的葡萄糖代谢途径与人类非常相似，是近年研究糖尿病的一种新兴模型动物，在斑马鱼上可以进行高通量的药物筛选实验，以及各种复杂的影像学检查，因此，斑马鱼在糖尿病视网膜病变的研究中亦越来越受欢迎[14]；猕猴、猪、大鼠、小鼠的视网膜毛细血管网状结构发育良好，适于人类视网膜毛细血管相关疾病的研究，其中大、小鼠获取容易，操作相对简便，成本较低，但如果是针对黄斑区视网膜毛细血管尤其是拱环结构的研究，猕猴则是不二选择[15]。

2.2 中医眼科动物模型的种类

目前，用于中医药研究的动物模型主要有3类：疾病动物模型，证候动物模型以及病证结合动物模型。（1）疾病动物模型：将西医病因病理因素施加于实验动物，建立符合西医或中医疾病的动物模型；（2）证候动物模型：采用物理、化学、生物等因素，或依据中医病因病机理论，将六淫、七情、痰饮、劳倦等致病因素施予实验动物，复制出类似于中医临床证候的动物模型。如大鼠皮下注射肾上腺素所致的“血瘀”证模型，将大鼠置于冰水所建立的“寒凝血瘀”模型等；（3）病证结合模型：指在中医理论指导下，结合现代医学理论与实验动物学知识，采用现代医学病因和/或传统中医学病因复制动物模型，使之同时具备疾病和证候的特征[16]。例如，刘建勋团队[17-18]在小型猪高脂血症的基础上，采用心导管介入造成冠状动脉前降支血管内皮损伤，促使内膜下的脂质沉积和动脉粥样硬化形成，通过心肌缺血面积测量、病理学等客观指标分析，以及体重指数、舌象、脉象等证侯指标评价，发现建立的动物模型与临床上冠心病痰瘀互结证非常吻合。病证结合动物模型符合中医理论，能更好体现疾病的特点，已成为目前中医药动物模型研究的热点和重点[19]。

相较其他专业而言，中医眼科关于动物模型研究相对缺乏，病证结合眼科模型更是鲜有报道。目前所用的模型主要是基于西医病因、病理所建立的疾病模型。以干眼动物模型为例，或通过摘除泪腺及哈氏腺、烧灼泪腺导管破坏结构及功能，或采用阿托品等胆碱能受体阻断剂抑制副交感神经兴奋，导致泪液分泌减少，建立泪液缺乏型干眼模型[20-21]；或从病因角度，以完全缺乏维生素A 的饲料干酪素为主喂养家兔，导致上皮细胞过度角化、泪腺分泌减少、角膜上皮及结膜干燥而引起干眼[22]；亦或通过去势方法使雄激素降低，继而引起结膜杯状细胞数量减少及睑板腺分泌功能下降，以此建立蒸发过强型干眼模型等[23]。又如糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)模型，常用的是通过链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)选择性破坏胰岛β 细胞建立糖尿病模型，在一定的病程基础上形成DR 模型，观察中药对DR 的干预作用[24]；亦有将幼鼠连续5 d 置于密闭的高氧环境，以视网膜新生血管及炎症相关因子为评价指标，构建DR病理模型[25]；db/db小鼠具备人类糖尿病视网膜神经退行性特征，因此该小鼠被用来研究中医药对DR的神经保护作用[26]。同样，青光眼模型也多是采用疾病模型的建模方法，根据眼压是否增高分为高眼压型青光眼动物模型和非高眼压视神经损伤型青光眼模型，前者构建方法包括前房注射特定物质、激光光凝、巩膜上静脉高渗盐水注射、巩膜上静脉烙闭等，后者包括视网膜缺血再灌注、机械损伤与视网膜神经节细胞兴奋性毒性化学物质损伤等[27-28]。

2.3 中医眼科模型存在的问题

理想的疾病动物模型应尽可能满足与人类疾病相符合的“三性”特征，即发病机理同源性、行为表象一致性、药物治疗预见性。同时具有创建易行性、重现性与经济性的特点[29]。目前中医眼科模型存在的问题包括：（1）模型与临床表现不一致，这也是西医疾病模型的共性问题。大多数疾病的发生是由多因素参与的复杂过程，而目前采用的单因素造模往往不能模拟真实的病变过程。例如，采用各种方法诱导的年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD）动物模型，仅能模拟一个或少数几个AMD病理特点，极少有模型能够呈现从早期进展为晚期的病变过程[30-31]。人类AMD 是一个多因素共同作用，光感受器细胞、视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）细胞和脉络膜毛细血管之间相互影响而形成的复杂“系统”的表现。张晶等[32]根据AMD 发病的高风险因素，以烟草中的主要成分氢醌喂食联合慢性光照诱导小鼠AMD 模型，发现模型组小鼠视网膜功能较正常组下降，感光细胞计数减少，膜盘结构松散变形，RPE 层萎缩，Bruch 膜的结构破坏、外胶原层出现层状沉积物，并可见血管内皮细胞突入Bruch 膜内，免疫荧光检测发现RPE 层血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及CD31 的表达增强，提示视网膜下新生血管发生，上述表现与人AMD 的发病进程和特点非常接近，但造模时间过长是该模型一个明显的缺点。（2）目前现有的模型制作多采用病理模型方法，评价指标缺少中医药特色。例如，巩膜上静脉烙闭建立的慢性高眼压模型是中医学者们常用的青光眼模型[33-35]，该方法是通过烙闭大鼠2 条及以上的巩膜上静脉，使巩膜上静脉压力升高，阻碍房水从Schlemm管排出，从而引起眼压增高。学者们研究的治则方药不同，但观察指标基本一致，多采用眼压、视网膜组织病理改变、视网膜神经节细胞的凋亡率等反映病理特征的指标。目前已经公认青光眼发病机制复杂，除了解剖结构之外，还与情绪等因素有关，如何构建七情致病模型？烙闭巩膜上静脉除引起眼部表现外，是否会引起大鼠全身症状、体征改变，表现出某种证候特征？不同的治法方药作用于同一个模型，是否有不同的治疗效果？对上述问题的解答有助于更深入地阐释中医药防治青光眼的作用及机制。

3 中医眼科动物模型展望

与西医眼科相比，中医眼科最大的特点及优势是整体观。中医理论认为眼与脏腑、经络、气血、津液密切相关，眼部疾病是机体失调的局部反应，诊断方面强调辨病与辨证相结合，治疗方面注重通过全身调理达到治疗眼病的目的。因此，在应用动物模型研究中医药的作用及机制时应该将证候因素考虑在内，这样才能全面诠释中医药的作用特点。有学者认为动物不能开口讲话，无法切脉，难以采集四诊资料，对病证结合动物模型持怀疑和否认态度。但是，随着科技的发展以及研究手段的不断更新，建立富有中医药特色的动物模型已逐渐可行并成为未来研究的趋势。

3.1 建立病证结合中医眼科动物模型

目前常见的病证结合动物模型制备思路有2种：单纯西医疾病动物模型观测法及西医病理机制复合中医病因病机造模法[36]。前者是采用疾病模型的建立方法，在观察内容上增加证候相关指标。苗明三等[37]分析了过敏性结膜炎（allergic conjunctivitis,AC）动物模型，认为可以根据AC 的中医诊断，先主证，后次证，找到AC 外感风热证、脾胃湿热证和肝血不足证对应的中医指标。彭清华等[38]基于中西医临床病症特点对现有的的葡萄膜炎动物模型进行了归纳总结，建议在目前的评价指标体系中，增加生化指标、动物四诊资料并予以量化评价，通过积分标准进行中医证型诊断，建立病证结合葡萄膜炎动物模型。而第2种病证结合动物模型的建立方法则是将西医病理与中医病因联合起来建模，根据“病”“证”因素施加顺序可分为：先证后病、先病后证及病证同步。孙河团队[39]采用行为束缚、冰水中游泳、45℃烘箱中热烘、夹尾、禁食等慢性不可预知性温和应激刺激等方法制作大鼠肝郁模型，并在此基础上给予巩膜上静脉高渗盐水注射制作大鼠青光眼模型，通过旷场试验及眼压检测评价，成功建立了富有中医特色的肝郁证青光眼模型。在今后的研究中这2 种方法都可以采用，第1种疾病建模方法具有较好的确认性、可控性和重复性，如果能通过宏观表征、微观指标、以方测证等方法验证某些眼科疾病模型已确实存在“证”的特征，则无需再施加证因建模。笔者在观察含氢醌饲料联合慢性光照建立的小鼠AMD模型时发现，除了眼部的病理改变外，小鼠出现食欲减退、饮水量减少，被毛无光泽，精神欠佳，活动度减少，大便稀软等全身症状，因此，推测这种小鼠模型可能同时具有脾虚痰湿证候，目前课题组正在做进一步的研究验证。第2 种建模方法吸收了中、西医在造模方面的成功经验，发挥了各自学科对病证产生的致病特点，有利于中西医结合理论研究的发展。但需要注意的是，中医证候是疾病某一阶段病因、病位、病性、病势及机体邪正盛衰的概括，如果缺乏逻辑关系将中医病因因素与西医病理因素强行叠加，则所建立的证候与期待建立的模型证候可能存在阶段性不一致的问题[40]。因此，在建模过程中要与临床实际密切结合，找准病证结合的切入点，不要将“证”游离于“病”之外。

3.2 建立病证结合眼科动物模型的评价方法

中医动物模型的评价方法随着“证”的研究进展，历经了单纯“证”的评价、“证”结合西医指标的评价、“以药（方）测证”评价、基于“组学”技术以及临床中西医病症特点的评价等[41]。虽然目前针对病证结合模型的评价还没有理想和成熟的方案，但眼科模型可以借鉴其他学科的经验并在实践中进行完善。基于临床中西医病症特点的评价方法，近几年报告较多，该方法将疾病的中西医诊断依据用于模型的评价，参考中医四诊、生化和病理等指标，既有对中医“证”的衡量，又将西医各方面指标纳入评判标准；依据中西医对疾病主次症状（指标）的认识，将评判标准分为不同的级别；同时，根据病种具体情况对不同级别的各个项进行再次分级；最终依据指标累加积分评价模型与临床的吻合度[42]。该方法已被尝试用于中医眼科模型的研究[37]。在评价过程中辨证规范化是重点和难点，大、小鼠四诊工作站的建立初步实现了大小鼠诊法的标准化与定量化[43]，动物症状信息的局限性可借助现代检测技术获取的客观指标来弥补。此外，必要时亦可基于“方证相应”的理论，运用经典方剂对病证结合动物模型进行干预，分析模型动物对不同治则方剂的反应性及特异性指标的改变，进而反测其证候属性[44]。

4 小结

中医药动物实验研究是沟通传统中医与现代医学的桥梁，病证结合眼科动物模型是现代中医眼科学实验研究的基石，可以帮助人们更深入地认识疾病，明确中医药的作用机制，对中医眼科学理论的传承创新，扩大中医药的国际认可度，新药、新技术的研发具有重要的作用及意义。相信随着中医眼科病证结合动物模型研究的逐渐深入，模型建立方法及其评价体系将会得到不断地修正与完善，并通过实践的验证，为中医眼科学的发展注入强大的生命力。最后，需要提及的是每一个生命都是有尊严的，动物为人类战胜疾病做出了重大贡献，感谢它们为人类健康所提供的一切!