一测多评法同时测定连翘归尾颗粒中3种成分

遆安航， 李思思， 陈 瑾， 翟康欣， 谭丽媛， 张淑蓉

(山西中医药大学，山西 晋中 030600)

连翘归尾煎出自《景岳全书》，由连翘、归尾、甘草、金银花、红藤组成，功效清热解毒、活血消肿[1]，可治疗乳痈、口疽、颊疡、牙痈、猪丹毒等[2]，方中连翘、金银花为君药，具有清热解毒、散结消肿作用[3]。课题组前期发现，该方在体内外实验中均显示对乳腺癌细胞的抑制作用，为了更有效地开展后期研究，保证实验样本前后的一致性，已将其改制成颗粒剂[4]。

为了降低检测成本，同时结合中药中多种成分相互作用、复杂多变等特点[5]，采用一测多评法测定多指标成分含量已成为发展趋势和研究热点[6]。因此，本实验建立该方法同时测定连翘归尾颗粒中连翘酯苷A、绿原酸、连翘苷的含量[7]，以期为该制剂质量控制和评价提供参考。

1 材料

1.1 仪器 数显电热套购自金坛市杰瑞尔电器有限公司(型号HDM500-10450)；中药材粉碎机购自广州真麦机械设备有限公司(型号LG-50)；恒温水浴锅购自上海比朗仪器制造有限公司(型号HH-2)；旋转蒸发仪购自巩义市英峪弘源仪器厂(型号RE-5205)；超声波清洗机购自杭州法兰特超声波科技有限公司(型号SB-5200 DTDN)；高效液相色谱仪购自杭州瑞析科技有限公司(型号Waters e2695)、上海诺析仪器有限公司(型号Agilent 1260)；电动喷雾器购自武汉药科新技术开发有限公司(型号CS-1020E)；电子天平(十万分之一)购自瑞士梅特勒-托利多公司(型号AE240)。

1.2 试剂与药物 连翘归尾颗粒(批号201020、201121、201222)及各阴性颗粒均为自制。绿原酸(批号110753-201716，纯度>98%)、连翘酯苷A(批号111810-201606，纯度>98%)、连翘苷(批号110821-200610，纯度>98%)对照品及连翘(批号120908-201216)、金银花(批号121060-201608)、甘草(批号120904-201605)、大血藤(批号121353-201704)对照药材均购自中国食品药品检定研究院。乙腈为色谱纯(河南萨默生物科技有限公司)；甲酸、甲醇为分析纯；水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Thermo Scientific BDS HYPERSIL C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相乙腈(A)-0.1%甲酸(B)，梯度洗脱(0～6 min，5%～9%A；6～9 min，9%～12%A；9～22 min，12%～14%A；22～35 min，14%～24%A；35～40 min，24%～26%A)；体积流量1.0 mL/min；柱温25 ℃；检测波长278 nm；进样量10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 供试品溶液 精密称取本品粉末(过6号筛)2 g，置于具塞锥形瓶中，加20%乙醇10 mL，密塞，浸泡40 min，称定质量，超声(功率250 W、频率45 kHz)处理45 min，放冷，20%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.2.2 对照品溶液 精密称取连翘酯苷A、连翘苷、绿原酸对照品适量，置于5 mL量瓶中，50%甲醇定容至刻度，摇匀，即得(三者质量浓度分别为0.538、0.066、0.222 mg/mL)，在4 ℃下保存。

2.2.3 阴性样品溶液 将缺连翘、缺金银花和大血藤阴性样品研成粉末，过6号筛，分别精密称取2 g，按“2.1.2”项下方法制备，即得。

2.3 专属性考察 取“2.2”项下供试品、对照品、阴性样品溶液适量，在“2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，各成分色谱峰均能达到基线分离，表明该方法专属性良好。

2.4 线性关系考察 分别精密量取“2.2.2”项下对照品溶液4、8、16、24、32、40 μL，置于2 mL量瓶中，50%甲醇定容至刻度，摇匀，得不同质量浓度，在“2.1”项色谱条件下进样测定。以对照品峰面积为纵坐标(Y)，质量浓度为横坐标(X)进行回归，得方程分别为连翘酯苷AY=888 061X-51 410(r=0.999 9)，线性范围1.08～10.76 μg/mL；连翘苷Y=747 692X-3 710(r=1.000 0)，线性范围0.13～1.32 μg/mL；绿原酸Y=1 798 549X-26 262(r=0.999 9)，线性范围0.44～4.44 μg/mL，均呈现良好的线性关系。

2.5 精密度试验 精密量取“2.2.2”项下对照品溶液16 μL，置于2 mL量瓶中，50%甲醇定容至刻度，摇匀，在“2.1”项色谱条件下进样测定6次，测得连翘酯苷A、连翘苷、绿原酸峰面积RSD分别为0.16%、0.07%、0.48%，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验 将同一批本品(批号201020)研成粉末，过6号筛，精密称取6份，每份2 g，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得连翘酯苷A、连翘苷、绿原酸含量RSD分别为2.88%、2.22%、2.65%，表明该方法重复性良好。

2.7 稳定性试验 将本品(批号201020)研成粉末，过6号筛，精密称取2 g，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，置于4 ℃冰箱中保存，每隔4 h取出，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得连翘酯苷A、连翘苷、绿原酸峰面积RSD分别为0.58%、1.03%、2.47%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.8 加样回收率试验 将各成分含量已知的本品(批号201020)研成粉末，过6号筛，精密称取1 g，置于锥形瓶中，精密加入适量对照品溶液，平行9份，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率[8]，结果见表1。

表1 各成分加样回收率试验结果(n=9)

2.9 相对校正因子计算 精密量取“2.2.2”项下对照品溶液5、10、15、20、30 μL，置于2 mL量瓶中，50%甲醇定容至刻度，摇匀，得不同质量浓度，在“2.1”项色谱条件下进样测定，以连翘酯苷A为内标，计算其他2种成分相对校正因子fk/s[9]，公式为fk/s=fk/fs=(CkAs)/(CsAk)，其中Ck为其他成分含量，Ak为其他成分峰面积，Cs为内标含量，As为内标峰面积，结果见表2。

表2 各成分相对校正因子

2.10 不同仪器、色谱柱对相对校正因子的影响 分别采用Agilent 1260型、Waters e2695型色谱仪，以及Thermo Scientific BDS HYPERSIL C18、Hypersil BDS C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，按“2.9”项下方法计算相对校正因子，平行6次，结果见表3，可知均无明显影响(RSD<3%)。

表3 不同仪器、色谱柱对相对校正因子的影响

2.11 色谱峰定位 考察了“2.10”项下仪器、色谱柱对相对保留时间的影响，结果见表4，可知均无明显影响(RSD<3%)。

表4 不同仪器、色谱柱对相对保留时间的影响

2.12 样品含量测定 取3批样品，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，各平行3份，在“2.1”项色谱条件下进样测定，分别采用外标法、一测多评法计算含量，结果见表5。由此可知，2种方法所得结果接近[相对误差(RE)<1%]，表明一测多评法可用于含量测定。

3 讨论

现代药理研究表明，连翘酯苷A、连翘苷具有抗菌、抗衰老等作用[10-12]，绿原酸具有抗内毒素、抗肿瘤等作用[13-14]，均与连翘归尾煎功能主治相符。由于连翘酯苷A在HPLC色谱图中的出峰位置位于绿原酸和连翘苷的中间，并且性质较稳定，故本实验以其为内标进行含量测定。

本实验考察了流动相乙腈-0.2%甲酸、乙腈-0.1%甲酸的分离效果，发现以乙腈-0.1%甲酸洗脱时各成分基线分离较好，符合实验要求。

4 结论

目前，有关一测多评法的报道大多是测定同一味药中同一种类成分的含量[15-16]，而本实验测定了连翘归尾颗粒中不同种类成分的含量，并且该方法具有专属度高、重复性好、稳定性强、快速简便、节约成本等优点，可为该制剂质量控制和评价提供参考依据。