UPLC-MS-MS法同时测定复方益肝丸中12种成分

梁 艳， 张 峰

(1.河南应用技术职业学院，河南 郑州 450040；2.开封市食品药品检验所，河南 开封 475001)

复方益肝丸是由茵陈、野菊花、牡丹皮等28味中药组成的复方制剂，主治清热利湿、疏肝理脾[1]，方中茵陈和野菊花所含绿原酸、青皮所含橙皮苷、枳壳所含柚皮苷、牡丹皮所含丹皮酚、桂枝所含桂皮醛均具有抗氧化、抗炎活性，而柴胡所含柴胡皂苷具有保护肝脏作用，车前子所含毛蕊花糖苷具有抗血栓、抗肿瘤等作用[2-5]，并且五味子所含五味子醇甲对肝脏受损细胞保护，以及大黄所含大黄酸、大黄素利肝功效也起到协同作用。文献[5]采用HPLC法对复方益肝丸中丹皮酚、大黄素、大黄酸进行含量测定，但未涉及君药茵陈主要成分绿原酸，同时含量较低的橙皮苷、柴胡皂苷A、柴胡皂苷D均无法以紫外检测器进行定量。因此，本实验首次建立UPLC-MS/MS法同时测定复方益肝丸中绿原酸、毛蕊花糖苷、柚皮苷、橙皮苷、桂皮醛、丹皮酚、甘草酸、大黄酸、柴胡皂苷A、五味子醇甲、柴胡皂苷D、大黄素的含量，以期为该制剂质量控制提供技术支撑。

1 材料

Waters 2695e-Xevo TQ-S Micro超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪(美国Waters 公司)；KQ-250ES超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)；New Classic电子天平(十万分之一，瑞士Mettler-Toledo公司)。绿原酸(110753-201415，纯度96.2%)、毛蕊花糖苷(111530-201914，纯度95.2%)、柚皮苷(110722-201815，纯度91.7%)、橙皮苷(110721-201617，纯度96.1%)、桂皮醛(110710-201821，纯度99.6%)、丹皮酚(11708-201908，纯度99.8%)、甘草酸铵(110731-202021，纯度96.2%)、大黄酸(110757-201607，纯度99.3%)、柴胡皂苷A(110777-201912，纯度94.8%)、五味子醇甲(110857-201815，纯度99.7%)、柴胡皂苷D(110777-201912，纯度94.8%)、大黄素(110756-201512，纯度98.7%)对照品均购自中国食品药品检定研究院。甲酸、甲醇、乙腈为色谱纯(德国默克公司)；乙醇为分析纯；水为自制超纯水。

2 方法与结果

2.1 UPLC-MS/MS条件

2.1.1 色谱 Phenomenex Kinetex C18色谱柱(2.1 mm×50 mm，2.6 μm)；流动相乙腈(A)-0.1%甲酸(B)，梯度洗脱(0～0.8 min，88%B；0.8～2.5 min，88%～70%B；2.5～8 min，70%～30%B；8～8.5 min，30%～88%B；8.5～13 min，88%B)；体积流量0.35 mL/min；柱温35 ℃；进样量2 μL。

2.1.2 质谱 电喷雾离子源(ESI)；多反应监测(MRM)模式，正负离子扫描；喷雾电压3.1 kV；锥孔电压40 V；干燥氮气温度450 ℃，体积流量 950 L/h；碰撞气Ar；雾化器压力248 kPa；离子源温度155 ℃，其他质谱参数见表1。

表1 各成分质谱参数

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 分别取橙皮苷、丹皮酚、甘草酸、大黄酸、绿原酸、柴胡皂苷A、毛蕊花糖苷、五味子醇甲、柴胡皂苷D、大黄素对照品约10 mg，精密称定，置于10 mL量瓶中，甲醇超声溶解并稀释至刻度，作为贮备液(1.00 g/L)。再分别取桂皮醛、柚皮苷对照品约10 mg，精密精定，置于50 mL量瓶中，加入上述贮备液，70%乙醇稀释至刻度，即得(毛蕊花糖苷、柚皮苷、橙皮苷、桂皮醛、丹皮酚、甘草酸、大黄酸、柴胡皂苷A、五味子醇甲、柴胡皂苷D、绿原酸、大黄素质量浓度分别为0.040 88、0.201 8、0.010 35、0.204 2、0.104 6、0.102 6、0.040 44、0.010 22、0.040 76、0.010 48、0.101 1、0.040 68 g/L)。

2.2.2 供试品溶液 取本品20丸，研碎，取约0.2 g，精密称定，置于250 mL锥形瓶中，加入约50 mL无水乙醇超声处理30 min，滤过，滤液置于200 mL量瓶中，残渣转移至锥形瓶中，加入70%乙醇约100 mL，60 ℃水浴加热回流提取90 min，放冷，滤过，滤液滤入量瓶中，70%乙醇洗涤残渣并稀释至刻度，即得。

2.2.3 阴性样品溶液 参照文献[1]中的处方，分别取除野菊花、茵陈、车前子、大黄、青皮以外的23味药材(阴性样品Ⅰ)，除牡丹皮、枳壳、桂枝、五味子、柴胡、炙甘草以外的22味药材(阴性样品Ⅱ)，除野菊花、茵陈、车前子、牡丹皮、大黄、青皮、枳壳、桂枝、五味子、柴胡、炙甘草以外的17味药材(阴性样品Ⅲ)，分别按“2.2.2”项下方法制备，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性考察 取对照品、供试品、阴性样品溶液适量，在“2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图1～5。由此可知，各成分峰形良好，阴性无干扰，表明该方法专属性良好。

2.3.2 线性关系考察 精密吸取对照品溶液适量，70%乙醇稀释至系列质量浓度，在“2.1”项条件下进样测定。以对照品峰面积为纵坐标(Y)，质量浓度为横坐标(X)进行回归，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系

2.3.3 精密度试验 取“2.3.2”项下中间质量浓度对照品溶液，在“2.1”项条件下进样测定6次，测得绿原酸、毛蕊花糖苷、柚皮苷、橙皮苷、桂皮醛、丹皮酚、甘草酸、大黄酸、柴胡皂苷A、五味子醇甲、柴胡皂苷D、大黄素峰面积RSD分别为2.82%、2.46%、2.54%、3.02%、2.84%、2.63%、2.25%、3.06%、3.22%、2.77%、3.41%、2.99%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 重复性试验 取同一批样品6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项条件下进样测定，测得绿原酸、毛蕊花糖苷、柚皮苷、橙皮苷、桂皮醛、丹皮酚、甘草酸、大黄酸、柴胡皂苷A、五味子醇甲、柴胡皂苷D、大黄素含量RSD分别为2.45%、2.34%、2.14%、2.94%、3.25%、3.22%、3.05%、2.47%、3.51%、3.33%、3.61%、2.84%，表明该方法重复性良好。

2.3.5 稳定性试验 取“2.3.4”项下供试品溶液，于0、2、4、8、12、20、24 h在“2.1”项条件下进样测定，测得绿原酸、毛蕊花糖苷、柚皮苷、橙皮苷、桂皮醛、丹皮酚、甘草酸、大黄酸、柴胡皂苷A、五味子醇甲、柴胡皂苷D、大黄素峰面积RSD分别为3.58%、3.24%、2.36%、3.14%、3.33%、2.46%、2.54%、2.45%、3.22%、3.61%、3.05%、3.37%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.6 加样回收率试验 取各成分含量已知的本品9份，每份约0.1 g，精密称定，置于250 mL锥形瓶中，精密量取“2.2.1”项下溶液0.25、0.5、0.75 mL，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液各3份，在“2.1”项条件下进样测定，计算回收率。结果，绿原酸、毛蕊花糖苷、柚皮苷、橙皮苷、桂皮醛、丹皮酚、甘草酸、大黄酸、柴胡皂苷A、五味子醇甲、柴胡皂苷D、大黄素平均加样回收率分别为98.34%、98.02%、98.98%、98.20%、97.16%、97.89%、98.10%、99.42%、97.07%、98.59%、97.60%、98.06%，RSD分别为2.01%、1.92%、1.64%、2.23%、2.73%、1.82%、2.26%、2.61%、2.08%、2.16%、2.73%、2.32%。

2.3.7 样品含量测定 取3批样品，每批2份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项条件下进样测定，计算含量，结果见表3。

表3 各成分含量测定结果(mg/g)

3 讨论

课题组前期查阅文献[6-8]发现，各成分的提取方法有浸渍法、水提法、超声波提取法、回流提取法，考虑到乙醇无毒，故联合应用超声波提取法和回流提取法，此时提取率较高[9]。本实验分别采用不同体积分数乙醇超声、回流提取，发现先用无水乙醇超声提取，再用70%乙醇回流提取时效果最佳；分别考察了回流时间30、60、90、120、150 min，发现超过90 min后各成分提取率无明显变化；由于柴胡皂苷热稳定性较差，故选择提取温度为60 ℃。另外，各成分在不同pH值下的稳定性有所差异，同时考虑到溶剂效应的影响，最终选择70%乙醇作为溶剂对样品进行稀释。

在筛选色谱条件时，本实验比较了流动相0.1%甲酸-甲醇、0.1%甲酸-乙腈、乙酸铵缓冲盐-甲醇、乙酸铵缓冲盐-乙腈[10-18]，发现0.1%甲酸-乙腈梯度洗脱时各成分拖尾因子均最理想。同时，在多反应检测模式下对正负离子进行切换扫描，可得到较高的灵敏度，从而保障了方法的专属性。

4 结论

本实验首次建立UPLC-MS/MS法同时测定复方益肝丸中绿原酸、毛蕊花糖苷、柚皮苷、橙皮苷、桂皮醛、丹皮酚、甘草酸、大黄酸、柴胡皂苷A、五味子醇甲、柴胡皂苷D、大黄素的含量，该方法专属性强，速度快，灵敏度高，可为该制剂质量控制提供参考。