丹皮酚对佐剂性关节炎大鼠继发性炎症的作用

杨小四， 姚文兵， 胡华麟， 刘 毅

(1.安庆医药高等专科学校医学基础部，安徽 安庆 246052；2.安庆医药高等专科学校药学系，安徽 安庆 246052)

类风湿关节炎属于多关节累积的滑膜炎性病变，炎症刺激关节滑膜增生，新生血管形成，但确切病因未明[1]。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路异常参与滑膜炎症，针对该信号通路设计药物靶点是目前治疗类风湿关节炎的一个关注方向[2-3]。目前，临床类风湿关节炎治疗中常用的抗风湿药、非甾体抗炎药和糖皮质激素等均有一定局限性，生物制剂大多价格昂贵[4-5]。天然中草药提取物因其在抗风湿中具有一定疗效，价廉且副作用小而广泛应用于类风湿关节炎治疗[6]。毛莨科植物牡丹皮的提取物丹皮酚具有消炎作用，有文献报道，其对实验动物关节炎有抑制作用，可以抑制致炎细胞因子产生[7]，但其机制并不确定。佐剂性关节炎动物模型为免疫性关节炎性模型，其病程中动物表现的症状和病理变化类似于类风湿关节炎，被广泛应用于类风湿关节炎研究[8]。本研究通过构建佐剂性关节炎大鼠模型，观察丹皮酚对佐剂性关节炎大鼠关节滑膜组织中p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)表达的影响，探讨丹皮酚改善佐剂性关节炎大鼠关节功能的部分机制，为中药丹皮酚治疗类风湿关节炎提供理论依据。

1 材料

1.1 动物 健康成年雄性SD大鼠60只，体质量(210±10)g，购买并饲养于安徽省动物实验中心，实验动物生产许可证号SCXK(皖)2017-001，每笼5只，饲养环境为相对湿度(50±5)%，温度(25±2)℃，采取灯光照明，明暗12 h/12 h交替，饲喂颗粒食用饲料，自由饮水。本实验经安徽省动物实验伦理委员会批准(伦理审查号AH.20190903c0600105)。

1.2 试剂与药物 丹皮酚(纯度>99%，成都瑞芬思生物科技有限公司，批号552-41-0)。p38 MAPK抑制剂SB203580(美国Cayman公司，批号13067-5)；弗氏完全佐剂(freunds complete adjuvant，FCA)(浙江联硕生物科技有限公司，批号F5881)；水合氯醛(山东济南嘉格生化科技有限公司，批号312-07-3)；大鼠IL-1β、IL-10、TNF-α酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(上海恪敏生物科技有限公司，批号KB1822、KB3911、KB2720)；苏木精(北京索莱宝科技有限公司，批号H8070)；TRIzol(美国Invitrogen公司，批号19206038)；PCR逆转录试剂盒(美国Gene Copoeia公司，批号2037901801)；羊抗鼠p38 MAPK抗体、羊抗鼠β-actin抗体(美国Santa Cruz公司，批号SC00238、SC69879)；二抗兔抗羊辣根过氧化物酶标记免疫球蛋白(Ig)G(北京华美生物技术公司，批号2020-07-29)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司，批号AR0146)。

1.3 仪器 病理切片机(德国Leica公司，型号RM2235)；高速冷冻离心机(美国Eppendorf公司，型号55362R)；倒置荧光显微镜(日本Olympus公司，型号olympusix71)；酶标仪(美国Wisdom公司，型号6500)；实时荧光定量PCR仪(德国Roche 公司，型号LightCycler96)。

2 方法

2.1 动物分组、造模、给药及标本处理 SD大鼠适应性喂养1周后，按随机数字表分为对照组(10只)和佐剂性关节炎造模组(50只)。佐剂性关节炎动物模型制备依据文献[9]报道，在大鼠左后肢足趾皮下注射FCA 0.1 mL，对照组注射等容量生理盐水。致炎12 d后，50只造模组再随机均分为模型组(生理盐水)，丹皮酚低、中、高剂量组(8、16、32 mg/kg)，SB203580 组(2 mg/kg)，每组10只，灌胃给予相应剂量药物，对照组灌胃给予等量生理盐水，连续16 d。腹腔注射水合氯醛进行麻醉，抽取5 mL股动脉血，6 000 r/min离心10 min，分离得到血清，于-20 ℃冰箱保存。每组取3只大鼠踝关节做形态学研究，另7只踝关节滑膜组织作分子生物学研究。

2.2 继发性关节炎的症状判定 根据课题组前期报道[10]，致炎12 d开始，每4 d观察并记录继发性关节改变情况。主要观察指标为①关节肿胀度，采用容积测量仪，排水法检测大鼠右后肢(非致炎侧)踝关节容积改变，公式为踝关节容积改变(ΔmL)=致炎后右后肢容积-致炎前右后肢容积。②关节炎指数，采用双盲法三人观察计分，计算除致炎侧外其它关节情况，0分，关节无明显结构变化；1分，某1个肢体关节轻微肿胀或有红斑；2分，≥2个肢体关节轻微肿胀或有红斑；3分，≥2个肢体关节肿胀或红斑；4分，≥2个肢体关节明显肿胀，站立不稳，计算3个关节累计得分，最高12分。

2.3 ELISA法检测细胞因子水平 取大鼠血清，严格按照酶联免疫吸附试剂盒说明书配置标准品和检测溶液，根据操作步骤检测血清IL-1β、TNF-α、IL-10水平，酶标仪检测波长为450 nm的吸光度(A)值。

2.4 踝关节p38 MAPK单克隆抗体免疫组化病理学检查 10%福尔马林充分固定踝关节后，经脱钙、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片，得到石蜡切片，脱蜡后微波抗原修复，H2O2室温避光作用以消除内源性过氧化物酶，山羊血清封闭，滴加一抗羊抗鼠p38 MAPK单克隆抗体(1∶300)50 μL，4 ℃孵育过夜，次日滴加50 μL兔抗羊辣根过氧化物酶标记免疫球蛋白(Ig)G二抗染液，DAB显色，苏木精复染细胞核，经乙醇脱水、二甲苯透明、中性树脂封片后镜检，阴性对照采用PBS代替一抗染色，细胞质(或核)呈黄色或棕黄色为阳性显色。采集图像，南京捷达JD80i软件分析图像，参照文献[10]报道计算p38 MAPK阳性细胞吸光度(A)值。

2.5 RT-qPCR检测p38MAPKmRNA表达 取冻存大鼠滑膜组织块并剪碎，采取TRIzol法提取RNA，检测RNA浓度。严格按照反转录试剂盒说明书，将mRNA反转录为cDNA，PCR引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成，p38MAPK正向序列5′-CGGTGTGTGCT GCTTTTGAT-3′，反向序列5′-CTGTAGCTTCCTTTTGGCGTG-3′；β-actin正向序列 5′-TGCTATGTTGCCCTAGACTTCG-3′，反向序列5′-GTTGGCATAGGTCTTTACGG-3′。RT-qPCR反应体系共20 μL，反应条件为95 ℃预变性5 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，循环45次。熔解曲线反应条件为95 ℃ 5 s，65 ℃ 1 min，冷却。实验结果以2-ΔΔCT法表示。

2.6 Western blot检测p38 MAPK蛋白表达 取冻存大鼠滑膜组织块并剪碎行，加入10倍体积蛋白裂解液，充分裂解后提取滑膜组织中总蛋白，采取BCA法检测蛋白浓度，然后加入蛋白上样缓冲液，水浴锅煮沸加热3～5 min，冷却后定量并制备上样液进行SDS-PAGE电泳，转移至PVDF膜，脱脂奶粉液中室温摇床封闭30 min，加入一抗p38 MAPK(1∶1 500)、β-actin(1∶3 000)，4 ℃孵育过夜，PBS洗涤3次，每次5 min，加入二抗(1∶3 000)37 ℃孵育30 min，显影与曝光，应用Image J软件分析蛋白的灰度值。

3 结果

3.1 丹皮酚对佐剂性关节炎大鼠继发性关节肿胀的影响 与对照组比较，致炎12 d(给药前)后，模型组大鼠继发性足肿胀度增加(P<0.01)；与模型组比较，致炎16 d(给药4 d)后，丹皮酚各剂量组和SB203580组均可抑制大鼠继发性足肿胀(P<0.05，P<0.01)，其中丹皮酚高剂量组作用更为明显，见图1。

3.2 丹皮酚对佐剂性关节炎大鼠继发性关节炎指数的影响 与对照组比较，致炎12 d(给药前)后，模型组大鼠非致炎侧足趾开始肿胀，随免疫时间延长而加重，直至大鼠站立困难，各时间点关节炎指数评分升高(P<0.01)；与模型组比较，致炎16 d(给药4 d)后，丹皮酚各剂量组和SB203580组均有效改善症状，关节炎指数评分降低(P<0.05，P<0.01)，其中丹皮酚高剂量组降低关节炎指数更明显，见图2。

3.3 丹皮酚对佐剂性关节炎大鼠血清炎症因子水平的影响 与对照组比较，模型组血清中炎症因子IL-1β、TNF-α水平升高(P<0.01)，IL-10水平降低(P<0.01)；与模型组比较，丹皮酚各剂量组和SB203580组IL-1β、TNF-α水平降低(P<0.05，P<0.01)，IL-10水平升高(P<0.05，P<0.01)，见图3。

3.4 丹皮酚对佐剂性关节炎大鼠踝关节p38 MAPK蛋白表达的影响 对照组有少量p38 MAPK蛋白阳性表达；与对照组比较，模型组大鼠关节滑膜组织增厚，p38 MAPK蛋白阳性表达增加(P<0.01)；与模型组比较，丹皮酚各剂量组和SB203580组大鼠关节滑膜组织p38 MAPK蛋白阳性表达降低(P<0.05，P<0.01)，且随着丹皮酚剂量的增加，p38 MAPK蛋白阳性表达下降，见图4、表1。

表1 丹皮酚对佐剂性关节炎大鼠踝关节p38 MAPK蛋白表达的影响

3.5 丹皮酚对佐剂性关节炎大鼠关节滑膜组织p38 MAPK mRNA和蛋白表达的影响 与对照组比较，模型组大鼠关节滑膜组织p38 MAPK mRNA和蛋白表达均升高(P<0.01)；与模型组比较，丹皮酚各剂量组和SB203580组大鼠关节滑膜组织p38 MAPK mRNA和蛋白表达均降低(P<0.05，P<0.01)，见图5。

4 讨论

中药制剂在药理中常具有多靶点、高安全性等优点，雷公藤多苷片[11]、青藤碱[12]、丹皮酚等抗炎、镇痛作用显著，常用于类风湿关节炎的治疗。丹皮酚是中药丹皮的提取物，具有凉血清热、活血化瘀作用，文献报道其有镇痛、抗炎、清除自由基、抗氧化、抗过敏、解热、抗肿瘤等多种功效[13]。本研究采取FCA局部注射大鼠足趾皮下构建佐剂性关节炎模型，是一种常见的类风湿关节炎动物模型，通过探究丹皮酚对佐剂性关节炎的影响，为丹皮酚在临床上用于治疗类风湿关节炎提供依据。研究表明，与模型组比较，第16、20、24、28天时，丹皮酚各剂量组大鼠继发性足肿胀程度和多发性关节炎指数评分呈剂量依赖性降低，表明丹皮酚可有效抑制佐剂性关节炎模型大鼠继发性炎症，降低关节肿胀症状，且呈剂量依赖性。

在类风湿关节炎发病过程中，患者体内细胞免疫系统活化，激活单核-吞噬细胞系统，导致血清炎细胞分泌改变，IL-1β 和TNF-α等致炎因子水平升高，IL-1β往往作为炎症的始动因素，刺激滑膜细胞和关节软骨释放前列环素E2和基质金属蛋白酶等，加重滑膜炎症反应，分解骨基质[14]; 同时，在类风湿关节炎的活动进展期，由单核-巨噬系统分泌的TNF-α呈高表达，且与疾病的严重程度呈正相关，驱动血液中性粒细胞和淋巴细胞向炎症部位积聚，级联机体炎症反应[15]。本研究表明，丹皮酚可调节佐剂性关节炎大鼠中细胞因子水平，使得致炎因子IL-1β和TNF-α水平降低，抑炎因子IL-10水平升高，从而减轻佐剂性关节炎大鼠关节炎症状，包括减轻足肿胀，降低肿胀度和多发性关节炎指数，延缓佐剂性关节炎的发病进程。

近年来，越来越多实验通过探讨类风湿关节炎的病理机制而寻求中药对其有效的治疗方法[16]，其中p38 MAPK信号通路是炎性改变的经典通路[17-18]。本研究表明，丹皮酚干预佐剂性关节炎模型大鼠16 d后，关节和膜组织炎性反应显著改善，关节表面滑膜组织和关节软骨组织中p38 MAPK蛋白表达下降，且在基因和蛋白表达上均表现出类似的结果。同时，本研究发现，p38 MAPK信号通路阻断剂SB203580可以改善佐剂性关节炎模型大鼠的关节炎症状，表明丹皮酚可能通过抑制p38 MAPK信号通路而改善佐剂性关节炎症状。

综上所述，丹皮酚具有抑制p38 MAPK信号通路，从而抑制炎性因子分泌，保护关节软骨和骨的作用，且呈剂量依赖性，本研究为丹皮酚治疗类风湿关节炎提供了新的理论基础。