基于网络药理学及实验验证探讨复方茴芹颗粒治疗前列腺增生的作用机制

李慧峰， 孟 霜， 王鑫鑫， 王旭艳， 孔祥鹏， 裴妙荣*

(1.山西中医药大学，山西省现代中药工程实验室，山西 晋中 030619；2.山西省中西医结合医院中心实验室，山西 太原 030013)

良性前列腺增生是一种常见于中老年男性，多伴有进行性尿频、尿急、夜尿频多、排尿困难、尿线中断等症状的泌尿系统疾病，属中医学“精癃”“癃闭”范畴[1]。流行性病学调查发现[2]，随着年龄的增长该病发病率呈递增趋势，其发病率50岁时约50%，80岁以后发病率接近90%。随着我国老龄化逐渐加剧，前列腺增生发病人数逐年增多，严重影响人们的生活质量，给社会带来了巨大的经济负担。目前针对前列腺增生的治疗主要包括手术治疗和化学药物治疗，手术治疗后遗症较多，如出血、尿失禁、电切综合征、逆行射精甚至引起勃起功能障碍等，且容易复发，痛苦大，有创伤[3]；化学药物治疗效果并不是很理想，只能缓解局部症状，无法改善全身症状。

复方茴芹颗粒由山西省国医大师王世民教授根据前列腺增生病因病机及临床用药经验研制而成，由羊红膻、葛根、山楂等5味中药组成，具有补肾气、化血瘀作用，治疗前列腺增生的疗效显著[4]，但其作用机制尚不明确。本文采用网络药理学对复方茴芹颗粒抑制前列腺增生的潜在靶点进行预测，分析其可能的作用机制，并用分子对接及动物实验给予验证。

1 材料

1.1 动物 SPF级SD雄性大鼠60只，体质量180～200 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号SCXK(京)2016-0011。饲养环境为室温24 ℃，12 h/12 h昼夜循环，空气流通，自由饮食饮水，适应性喂养7 d。本研究动物实验在山西中医药大学实验管理中心进行，经山西中医药大学医学伦理委员会批准(编号2021DW102)。

1.2 试剂与药物 复方茴芹颗粒(批号20190506，每袋10 g，相当于23.3 g生药)由山西中医药大学国医大师工作室提供。非那雄胺片(批号N011372，每片5 mg)购自杭州默沙东制药有限公司；丙酸睾丸素(批号T101368-25 g)购自阿拉丁试剂(上海)有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒(批号15E13B46)、增强型RIPA裂解液(批号15G23C02)、蛋白酶抑制剂(PMSF)(批号AR1178)、5× SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(批号15I15B12)、洗膜缓冲液(TBST)(批号AR0031)、SDS-PAGE凝胶试剂盒(批号15G16B38)、山羊抗兔IgG二抗(批号BA1054)均购自武汉博士德生物工程有限公司；预染蛋白质彩虹marker(10～180 kDa)(批号SW117)购自赛文创新(北京)科技有限公司；蛋白激酶B(Akt)一抗(批号ab179463)、B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)一抗(批号ab59348)均购自英国Abcam公司；细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)一抗(批号137F5)、磷脂酰肌醇-3-羟激酶(PI3K)一抗(批号19H8)、血管内皮生长因子A(VEGFA)一抗(批号65373S)、表皮生长因子(EGFR)一抗(批号4267T)均购自美国CST公司；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)(批号AB0037)购自北京百奥创新科技有限公司。

2 方法

2.1 药物化学活性成分的筛选及活性成分靶点的获取 通过TCMSP、TCMID及相关文献获取枸杞子、葛根、西洋参、山楂、羊红膻等5味中药的活性成分，TCMSP筛选活性成分的条件为生物利用度(OB)≥30%和类药性(DL)≥0.18。通过PubChem对筛选到的活性成分进行确认并下载活性成分对应的SMILES序列，将获得的SMILES序列输入Swiss Target Prediction数据库，得到活性成分的作用靶点，删除每味药物的重复靶点，整理得到复方茴芹颗粒的潜在靶点。

2.2 前列腺增生靶点的获取 利用GeneCards、OMIM数据库，以前列腺增生为关键词检索相关的靶点，合并2个数据库靶点，删除重复得到前列腺增生靶点。

2.3 蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络的构建 利用R软件，将得到的药物靶点与疾病靶点映射，取交集得到复方茴芹颗粒治疗前列腺增生的潜在靶点，并绘制药物-疾病Venn图。将得到的药物-疾病潜在靶点导入STRING平台，设置物种为“Homosapiens”，构建PPI网络。由于复方茴芹颗粒疾病靶点较多，利用R软件，将PPI网络进行柱状图可视化。将PPI网络结果导入Cytoscape3.8.2软件，利用MCODE插件对该结果进一步分析，得到潜在蛋白质功能模块并对其功能进行描述。同时通过CytoHubba3.8.2插件的MCC算法筛选Hub基因。

2.4 GO富集和KEGG通路分析 利用R软件对复方茴芹颗粒治疗前列腺增生的潜在靶点进行GO生物过程富集和KEGG通路富集分析，以P<0.05为筛选标准。

2.5 疾病-药物-成分-靶点网络通路的的构建 利用Cytoscape 3.8.2软件，设定药物-疾病靶点的degree值大于中位数的靶点来构建疾病-药物-成分-靶点网络通路图。得中位数为48，最大degree值为167，因此取degree值为48～167的靶点构建疾病-药物-成分-靶点网络通路图。

2.6 活性成分-靶蛋白分子对接 根据复方茴芹颗粒PPI网络药理学，选择degree值较大的靶蛋白Akt、EGFR，从UniProt数据库(http://www.uniprot.org/)下载，保存其PDB格式文件。选择异鼠李素、槲皮素、芹菜素-7-O-β-D葡萄糖苷、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷等潜在活性成分，通过PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载潜在活性成分的2D结构，通过 ChemOffice 2014软件将其能量最小化，并导出其3D结构。利用分子对接Autodock vina模拟软件，将经过脱水分子和加氢等预处理的靶蛋白存为pdbqt格式，将化合物设置成可旋转键后存为pdbqt格式，最终进行对接模拟计算。如果结合能<0 kcal/mol表明靶蛋白和化合物可自发结合，结合能≤-5.0 kcal/mol表明靶蛋白和化合物结合活性较好。

2.7 动物实验验证

2.7.1 造模及给药方法 参考文献[5]报道建立大鼠前列腺增生模型，大鼠按照3.5 mL/kg腹腔注射10%水合氯醛溶液进行麻醉，随机选取58只大鼠，无菌条件下切除双侧睾丸；剩余10 只大鼠作为空白组，切开外阴皮肤但不摘除睾丸。所有大鼠恢复1周，造模后第8天，从切除双侧睾丸大鼠中挑选50只恢复状态较好的去势大鼠，随机分为5组，即模型组、非那雄胺组及复方茴芹颗粒低、中、高剂量组，每组10 只。除空白组外，其余组大鼠皮下注射丙酸睾酮注射液5 mg/kg(以橄榄油为溶媒)；空白组大鼠皮下注射等量橄榄油，每天1次，连续30 d。自造模开始，复方茴芹颗粒低、中、高剂量组分别灌胃给予2.70、5.40、10.80 g/kg复方茴芹颗粒药液，非那雄胺组灌胃给予1 mg/kg非那雄胺片，正常组和模型组灌胃给予等量蒸馏水，每天1次，连续30 d。

2.7.2 样本采集 末次给药结束后，禁食不禁水12 h后称定体质量并记录，用10%水合氯醛溶液(3.5 mL/kg)腹腔注射进行麻醉，腹主动脉取血，采用ELISA法检测大鼠血清中睾酮(T)、双氢睾酮(DHT)水平。摘取完整前列腺组织，生理盐水清洗后，称定腺体质量，计算前列腺指数；取部分前列腹叶组织用10%甲醛固定，HE染色后光镜下观察前列腺结构；剩余前列腺组织经液氮速冻后移至-80 ℃冰箱保存，备用。

2.7.3 Western blot检测目的蛋白表达 取大鼠前列腺组织，加裂解液研磨到无肉眼可见组织块，冰上裂解30 min，BCA法检测蛋白浓度后加蛋白上样缓冲液，100 ℃煮沸20 min，10%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，湿法转膜，5%牛奶室温封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜，TBST清洗3 次，每次10 min，二抗室温孵育1 h，TBST清洗3 次，每次10 min，使用凝胶成像系统显影并拍照，通过Image J软件对所得条带进行灰度分析。

3 结果

3.1 复方茴芹颗粒治疗前列腺增生潜在靶点的获取 通过筛选得到前列腺增生作用靶点3 733 个，复方茴芹颗粒所含羊红膻、葛根、枸杞子等5味中药的作用靶点548个，通过R软件将得到的靶点映射，得到该复方治疗前列腺增生的潜在靶点346个，绘制Venn图，见图1。

3.2 PPI网络的构建与分析 将药物-疾病346个靶点导入STRING平台得到的PPI 网络信息，利用R软件将PPI网络信息可视化，得到频次排名前30的靶点见图2。导入Cytoscape 3.8.2软件中，运用MCODE插件分析得到Module，并保留其中3个评分最佳的生物学进程，见图3。同时利用CytoHubba插件中的MCC算法分析药物-疾病PPI网络中的每个节点，筛选排名前10的靶点，见图4，颜色从红到黄代表该靶点的重要程度递减，依次为STAT3、VEGFA、SRC、MAPK3、MAPK1、CASP3、HRAS、MTOR、BCL2L1、EGFR。

3.3 GO富集、KEGG通路分析及疾病-药物-成分-靶点网络通路的构建 通过R软件进行复方茴芹颗粒-前列腺增生潜在靶点的GO富集和KEGG通路分析。GO富集分析得到346个潜在靶点在208条GO条目上富集。前20条GO富集条目如图5所示，涉及蛋白激酶反应、类固醇反应、核受体反应等生物学过程。KEGG通路分析得到156条条目，其中包括PI3K-Akt、HIF-1、MAPK、癌症等信号通路，与前列腺增生相关性最高的前20 条通路如图6所示。疾病-药物-成分-靶点网络通路如图7所示。

3.4 复方茴芹颗粒核心成分与前列腺增生关键蛋白分子对接验证 将网络筛选的degree值较大的2个靶蛋白与药物活性成分进行分子对接验证，从PDB数据库获得所需格式文件，靶点Akt(PDBID：1UNQ)、EGFR(PDBID：5UG9)，所有受体文件脱去水分子和加氢等预处理后，利用Autodock vina模拟软件进行分子对接，得到分子对接验证结果，见表1。通过分子对接得到结合能≤-6 kcal/mol的“靶点蛋白-活性分子”12个。部分“靶点蛋白-活性分子”对接模式图，见图8。结果表明复方茴芹颗粒中的异鼠李素、山柰酚、槲皮素等潜在成分与关键靶点之间有很好的亲和力，可通过作用于相关核心靶点治疗改善前列腺增生。

表1 分子对接结合能结果

3.5 实验验证

3.5.1 复方茴芹颗粒对大鼠前列腺湿质量和前列腺指数的影响 与空白组比较，模型组大鼠前列腺湿质量及前列腺指数均升高(P<0.01)，说明前列腺增生模型造模成功；与模型组比较，非那雄胺组及复方茴芹颗粒各剂量组大鼠前列腺湿质量、前列腺指数均降低(P<0.05，P<0.01)，见表2。

表2 复方茴芹颗粒对大鼠前列腺湿质量和前列腺指数的影响

3.5.2 复方茴芹颗粒对大鼠血清性激素T、DHT水平的影响 与空白组比较，模型组大鼠血清T、DHT水平均升高(P<0.01)，说明在去势条件下，通过皮下注射丙酸睾酮注射液，使大鼠前列腺组织在外源性雄激素的作用下出现增生，表明大鼠前列腺增生模型成功；与模型组比较，非那雄胺组及复方茴芹颗粒各剂量组大鼠血清T、DHT水平均降低(P<0.05，P<0.01)，表明复方茴芹颗粒能抑制前列腺增生的发生，见表3。

表3 复方茴芹颗粒对大鼠血清性激素水平的影响

3.5.3 复方茴芹颗粒对大鼠前列腺组织形态的影响 空白组大鼠前列腺上皮、腺腔及间质均正常；模型组大鼠前列腺上皮明显增生，呈乳头状突向腔内，腺体增多，腺腔明显变形，结缔组织明显增生；复方茴芹颗粒低剂量组腺体较模型组少，乳头状结构减少；复方茴芹颗粒中剂量组腺腔变大，腺体数少，小部分呈乳头状突向腔内；复方茴芹颗粒高剂量组前列腺上皮、腺腔、间质基本恢复正常，极少部分呈乳头状突入腔内，形态学表现与非那雄胺组接近；非那雄胺组腺腔明显减少，偶有上皮细胞增生所致的乳头状皱褶突入腺腔，见图9。

3.5.4 复方茴芹颗粒对大鼠前列腺组织关键蛋白表达的影响 与空白组比较，模型组大鼠前列腺组织PI3K、Akt、Bcl-2、VEGFA、EGFR、ERK1/2蛋白表达升高(P<0.01)；与模型组比较，非那雄胺组及复方茴芹颗粒各剂量组PI3K、Akt、Bcl-2、VEGFA、EGFR、ERK1/2蛋白表达均降低(P<0.05，P<0.01)，见表4、图10。

表4 复方茴芹颗粒对大鼠前列腺组织关键蛋白表达的影响

4 讨论

前列腺增生是中老年男性常见病、多发病，随着老年化进程的加快，其发病率逐年升高[6]，但其发病机制尚不明确。中药复方是我国中医整体观、辨证论治在用药上的体现，具有多成分、多靶点、多途径、作用机制复杂的特点[7]。网络药理学利用节点和连接，从整体角度揭示了中药复方“药物-基因-靶点-疾病”之间复杂的生物网络关系，以此预测药物可能的作用机制，科学地解释中药复方的药理机制及配伍关系[8]。本研究通过对复方茴芹颗粒5味药材分析得到槲皮素、异鼠李素、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷等药物活性成分。槲皮素、异鼠李素均为黄酮类化合物，可延缓或抑制前列腺增生发展进程。施建丰等[9]研究发现，木犀草素通过调节p-STAT改变BMDM的极性从而调节炎症介质的表达。

经筛选得到与复方茴芹颗粒活性成分有较高结合活性的核心基因，在抑制前列腺增生中发挥主要作用，包括Akt、VEGFA、MAPK3、SRC、EGFR等。VEGFA是具有高度血管内皮细胞特异性的有丝分裂原，可促进内皮细胞增殖，增强血管通透性，促使新生血管的生成[10-11]。有研究表明，前列腺增生患者体内VEGF水平升高，但机制尚不明确[12]。MAPK是一种重要的蛋白激酶，在细胞生长、分化、凋亡过程中具有重要的调节作用[13]，ERK是其亚型之一，主要参与促进有丝分裂。EGFR与表皮生长因子和转化生长因子等配体结合后，形成二聚体与ATP结合而自身磷酸化，激活下游信号通路，调节前列腺细胞的增殖、凋亡以及血管生成[14]。

分析发现PI3K-Akt、HIF-1、MAPK等信号通路可能是复方茴芹颗粒治疗前列腺增生的主要途径。Bcl-2能够抑制细胞的凋亡，在前列腺增生患者中高表达[15-16]。有研究表明，阻断PI3K-Akt信号通路可以抑制前列腺增生[17]，PTEN抑癌基因可使PIP3去磷酸化而减弱来自PI3K的激活信号，间接抑制Akt的功能[18]，Akt蛋白表达降低，使其底物Bad蛋白磷酸化水平降低，Bad与Bcl-2形成复合体，使Bcl-2蛋白表达降低而表现促前列腺细胞凋亡的活性，抑制前列腺增生。研究发现，低氧诱导因子-1α(HIF-1α)在前列腺增生患者中高表达，可抑制前列腺增生[19-20]，未活化的Akt能降低HIF-1α及其转录靶基因VEGF的表达。VEGF介导的血管生成作用可能是SRC依赖[21]，抑制EGFR酪氨酸磷酸化，从而抑制MAPK级联反应[22]，使前列腺增生基质细胞ERK表达降低，抑制前列腺上皮细胞增长。

研究还将复方茴芹颗粒有效核心成分与关键靶基因进行了分子对接验证，证明了配体与受体均具有良好的亲和力。对PI3K-Akt、MAPK等信号通路的关键靶点进行Western blot验证，结果显示复方茴芹颗粒通过下调PI3K-Akt、MAPK等信号通路，抑制前列腺增生的发生发展。本研究为复方茴芹颗粒的临床应用提供了理论基础，但其具体的作用机制还需进一步实验研究。