微囊化胰岛移植优化策略研究进展

李万里 丰丙政 杨玉伟 吴玲玲 顾姗姗 蒋鹏 陈继冰 高宏君

1型糖尿病（type 1 diabetes mellitus，T1DM）在全球4.15亿糖尿病患者中约占10%[1]，其特征为胰岛素绝对缺乏。除常规胰岛素治疗外，胰岛移植是目前唯一可能的替代疗法，可长期稳定地控制血糖。在胰岛移植成为常规治疗方法之前，需要克服两个主要障碍：长期应用免疫抑制剂导致的不良反应和胰岛细胞来源不足。为此，微囊化胰岛移植技术应运而生，该技术旨在通过将移植胰岛包封在半透性的微囊中作为机械屏障，实现移植胰岛与宿主分离，保护移植胰岛免受免疫细胞以及抗体介导的排斥反应损伤。以微囊化技术产生的免疫保护使得胰岛在无需使用免疫抑制剂时即可进行移植，并可使用动物作为供体来源。尽管在动物研究中取得了一些令人鼓舞的成果，但免疫保护性移植物存活期仍较短，无法将该技术引入临床实践。因此，近年来关于如何提高微囊化胰岛移植效果的研究有所增加，干细胞在微囊化胰岛移植中的应用研究也逐步成为热点。因此，本文从影响微囊化胰岛移植技术应用的几个关键因素及干细胞在微囊化胰岛移植中的应用进行综述，以期为微囊化技术在胰岛移植中的成功应用提供参考。

1 微囊化胰岛移植的优化策略

微囊化胰岛移植的成功率可从多个角度提高，如通过微囊装置产生长期的免疫隔离、调节或降低移植物周围免疫反应、提高材料的生物相容性、选择合适的移植部位、促进移植物周围氧气和营养物质供应等方式，均可提高移植效果[2]，且各方式相辅相成，互相联系。

1.1 免疫隔离和免疫保护

在供体细胞和受体免疫细胞之间提供长期免疫屏障是理想胰岛封装材料的首要标准[2]。海藻酸盐（alginate，ALG）是目前微囊化胰岛移植研究中使用最广泛的材料[3]，其最重要的特征是可与多价阳离子选择性结合，形成ALG凝胶珠。但ALG缺乏明显的渗透选择性，不能实现包封胰岛的免疫隔离，因此需要用氨基酸聚合物如多聚-L-赖氨酸，对ALG微球进行常规的渗透选择性包封[4]。半透的多聚-L-赖氨酸层能有效地阻止免疫系统的大细胞和抗体进入，同时允许胰岛素、葡萄糖和营养物质通过[5]。

微囊对移植胰岛提供的保护作用有限，不能维持胰岛的长期存活。CXC趋化因子配体（CXC chemokine ligand，CXCL）12可阻挡效应性T细胞，用CXCL12包封供体胰岛可诱导局部免疫隔离，并在无系统性免疫抑制的情况下保护异种移植物的功能[6]。在糖尿病小鼠模型中，细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4-immunoglobulin，CTLA4-Ig）、抗CD154单抗和囊内CXCL12的三联疗法可保护成年猪的移植胰岛，减轻免疫损伤[7]。近年来，两亲性多肽（peptide amphiphile，PA）纳米基质凝胶也被用于免疫隔离。PA可与细胞外基质（extracellular matrix，ECM）组装形成纳米基质凝胶，模拟胰岛培养微环境和半透性免疫屏障，改善胰岛在炎症状态下的功能，延长胰岛存活时间，从而提高胰岛移植的成功率和疗效[8]。抗体积膨胀和压缩变形能力的混合结构具有更好的形状恢复性和长期回弹性，有望在没有慢性免疫抑制的情况下实现长期糖尿病逆转。用共价连接的聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）加强ALG水凝胶的离子凝胶网络，可以产生具有理想力学性能的杂化结构，且PEG-ALG网络在微尺度表面变形和小振幅剪切过程中表现出与ALG相似的渗透率，表明混合聚合物免疫隔离装置在体内的成功应用[9]。为了使微囊具有薄而稳定的聚合物膜，Toda等[10]使用PEG偶联磷脂和多层PEG膜进行细胞微囊化，发现由四臂PEG（相对分子质量为40）-马来酰亚胺制成的聚合物膜在细胞表面具有最高的稳定性，且不干扰胰岛β细胞分泌胰岛素。Mridha等[11]也描述了一种基于聚己内酯支架的3D生物打印装置，该装置包含免疫隔离微囊，当植入免疫功能正常的同种异体糖尿病小鼠皮下时，在不需要免疫抑制剂的情况下，小鼠血糖水平可以维持正常化至少2个月。以上内容表明通过不同形式的微囊化，可实现移植胰岛免疫隔离和免疫保护，最终可实现T1DM微囊化胰岛移植疗法，通过进一步改进设计可实现更佳的效果。

1.2 材料的生物相容性

目前微囊化胰岛移植技术的应用受到囊化材料生物相容性不足的限制，ALG的纯度、组成和微囊完整性等因素都可能导致微囊发生异物反应及囊周纤维化。除研究最多的ALG外，一些其它的生物材料也逐渐被科研人员们所关注，并表现出一些优良的特性。

1.2.1 ALG的纯度 适当纯化可改善ALG的生物相容性，与使用ALG粗品生产的微囊相比，使用纯化ALG生产的微囊可大大减少囊周纤维化。临床级商品化的ALG都会被纯化去除内毒素，以确保可供人类安全使用[4]。为减轻免疫反应，依靠超纯的聚合物是必不可少的，单体、催化剂和引发剂等多种存在于其中的杂质都可能表现出不利的生物学活性，导致封装的胰岛移植物失效。70%～90%的杂质可以通过电泳、Klock或改良的Klock萃取纯化除去[12]，纯化显著减轻了ALG引起的炎症反应。此外，已研究出化学修饰的ALG，进一步提高了ALG的生物相容性。有研究使用一种共价化学修饰的组合方法来创建ALG变异体的文库，发现3种含有三氮唑的类似物可减少啮齿类动物和非人灵长类动物的异物反应，三氮唑可使ALG产生一种新的水凝胶表面，抑制巨噬细胞的识别[13]。值得一提的是，纯化还需重点考虑ALG的黏度以及分子量，纯化时可尽量去除低分子量成分来增强ALG黏度，从而提高微囊的生物相容性[14]。

1.2.2 ALG的组成 ALG是由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古洛糖醛酸通过β-1，4-糖苷键连接成的天然多糖。制备的微囊中，古洛糖醛酸相比甘露糖醛酸占更高比例时，微囊具有更好的稳定性及更佳的生物相容性[15]。有学者表示，往Biodritin（一种以ALG为基础的材料）中添加单一成分如层粘连蛋白不仅不会干扰微囊的稳定性及生物相容性，还会促进胰岛素的释放[16]。Harrington等[17]开发了一种新型、无细胞毒性、非乳化的方法来生产与多种材料相容的水凝胶微囊，称为核-壳球化（core-shell spherification，CSS），即以透明质酸和PEG二丙烯酸酯（PEG diacrylate，PEGDA）两种水凝胶为原料制备微囊。在糖尿病小鼠腹腔注射聚PEGDA微囊化犬胰岛，可逆转糖尿病（长达16周）；注射甲基丙烯酸酯化透明质酸微囊化犬胰岛，可恢复正常血糖（3～4周）。总之，CSS提供了一种无毒的微囊化工艺，可与各种水凝胶类型兼容。

1.2.3 微嚢的完整性 移植微囊缺乏完整性是导致囊周纤维化及移植物丢失的主要原因。囊膜不稳定造成的破裂和囊膜表面的物理性不规则都会使微囊的完整性受到破坏。此外，趋化作用也起到了关键作用，在异种移植中，异种抗原的释放，特别是β-1，3-半乳糖的释放，可吸引并激活巨噬细胞，释放的白细胞介素（interleukin，IL）-1β、干扰素（interferon，IFN）-γ 和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-γ等细胞因子以及一氧化氮和氧自由基，可通过微囊的半透膜，影响移植物的功能和活力。改善微囊的生物相容性以减少囊周纤维化是微囊化胰岛移植成功的关键。含PEG的雷帕霉素包衣（rapamycincontaining PEG，Rapa-PEG）涂层能有效地抑制巨噬细胞的增殖，可能是提高异种胰岛微囊生物相容性的有效方法[18]。但PEG涂层可能不够牢固，采用过强的交联方法又可能会干扰雷帕霉素的释放，因此，还需更进一步的研究。Alagpulinsa等[19]发现在未使用免疫抑制剂时，与CXCL12共包封的人多能干细胞（human pluripotent stem cell，hPSC）生成的功能性β细胞可避免囊周纤维化，在较长时间内（>150 d）控制小鼠血糖。Farah等[20]发现将集落刺激因子1受体抑制剂GW2580植入人体胰岛微囊系统、基于电极的连续血糖监测设备和肌肉刺激设备，可抑制囊周纤维化，改善移植物功能。体外实验证实包封己酮可可碱的ALG微囊可改善囊周纤维化和胰岛活性[21]。微囊的地塞米松21-磷酸涂层可明显抑制微囊化异种胰岛移植后囊周纤维化，对胰岛的功能和存活无不良影响；体内外实验均证实葡聚糖包封的ALG微囊保存了胰岛功能，减少了囊周纤维化和炎症细胞浸润[22]。

1.2.4 其他材料 除ALG外，研究人员正试图寻求一些替代材料来改善微囊性能，如琼脂糖、纤维素、壳聚糖、聚氨酯、聚丙烯酸酯、PEG等。琼脂糖是从红藻细胞壁中提取的一种线状多糖，具有良好的生物相容性和生物降解性，在特定温度下可实现溶胶-凝胶转变。琼脂糖水凝胶由于其独特的易于改性及热性能，提高了微囊化胰岛移植的成功率。然而，琼脂糖在移植后随着时间的推移表现出一些不稳定性，一定程度上限制了其耐久性[3]。纤维素在自然界中存量丰富，其免疫原性较低，且不能在人体中降解。临床前研究证实了纤维素包封可促进胰岛的存活，有关方面的进一步研究将有助于阐明纤维素在封装策略中的作用[23]。壳聚糖分子量高，生物降解性及生物相容性好。使用壳聚糖水凝胶作为免疫隔离基质可以保护微囊化的胰岛细胞免受免疫反应，并在异种胰岛移植中对包封胰岛具有良好的保护作用[24]。聚氨酯具有良好的生物相容性，可大量制备，经过特定修饰可表现出更佳优良的包囊特性[23]。Liu等[25]提出了一种聚合物主链含有磺基甜菜碱的两性离子型聚氨酯，可通过静电纺丝制备成具有可调纳米孔结构的胰岛封装装置，其具有强大的机械性能，且在移植到小鼠腹腔后引起的异物反应较轻。聚丙烯酸酯是不可生物降解的聚合物，包括聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸乙酯、聚丙烯腈和聚丙烯酰胺。通过以不同比例混合两种或多种丙烯酸酯，可实现对物理性能的微调。聚丙烯酸酯在机械强度、渗透性、生物相容性和保持细胞活力等方面性能较好，但其用于胰岛包封的研究并不多，还需开展进一步的研究[23]。PEG水凝胶以其良好的生物相容性被广泛应用于胰岛包封，已在动物模型中观察到其可促进细胞存活[26]。然而，仍需进一步在大动物模型中验证PEG水凝胶的耐久性[3]。另外，PEG末端的羟基可修饰成一系列的PEG衍生物，而修饰后的PEG衍生物具有更佳的包封性[24]。

1.3 移植部位

为使微囊化的胰岛发挥正常功能，选择理想的移植部位必不可少。目前，大多数胰岛移植是通过肝门静脉进行输注，但肝脏可能不是微囊化胰岛移植的最佳部位，由于微囊化后的胰岛体积会增大，可能导致肝脏血管系统缺氧[27]，且存在出血或门静脉血栓形成的风险[28]。皮下间隙和肌肉是目前临床上较理想的植入部位。多项临床前和临床研究正在进行，以优化胰岛移植的位置[29]。目前，还没有临床研究评估微囊化胰岛移植到肌内部位的效果[23]。与肝门静脉移植相比，肌内移植相对简单，并发症少[2]，但低血氧可能影响胰岛存活。肾被膜是啮齿类动物胰岛移植的常选部位，但微囊化的胰岛体积增大，阻碍了肾被膜作为植入部位的潜在适用性。腹膜腔是目前用于测试新型包封策略或装置的常用植入部位，但植入包封胰岛后的异物反应和纤维化反应相比于皮下间隙和肾被膜等部位明显较高[23]。大网膜也是一个潜在移植部位，高度血管化的结构、较大的表面积以及承载大量胰岛的能力使其成为微囊化胰岛移植的理想场所。但与其他部位相比，大网膜移植更具侵入性，不能接受多次移植，因此，其安全性、有效性及适用性还需进一步验证[30]。总而言之，需综合考量微囊化胰岛的大小、数量等多种因素，以选择合适的部位。

1.4 氧气和营养物质供应

胰岛具有高度的代谢活性，需要大量的氧气及营养物质来维持正常功能。由于微囊的存在，胰岛氧气及营养物质供应均受到影响，大量的胰岛细胞因不可逆的慢性低氧应激及营养不足，发生细胞坏死或凋亡，成为微囊化胰岛移植技术临床应用的主要障碍之一[31]。因此，采取有效的策略来改善胰岛周围氧气和营养物质的供应对胰岛发挥正常生理功能至关重要。有团队研究了低氧对游离和微囊化成年猪胰岛在培养6 d过程中存活率、代谢活性的影响，证实在缺氧条件下，游离和封装的胰岛代谢活性都有下降趋势，但游离胰岛在6 d时出现大量细胞死亡，而微囊封装显著改善了胰岛的存活[32]。过碳酸钠和过氧化钙可作为胰岛潜在的补充氧源。Mcquilling等[33]研究表明过碳酸钠或过氧化钙等产氧材料可为游离胰岛和封装胰岛补充氧气，提高移植胰岛的活性。

胰岛微囊化过程中无法控制微囊的大小、形状及微结构的一致性[34]，导致营养物质供应存在明显的差异化。尽管ALG微囊化技术在啮齿类动物中取得了成功，但由于微囊尺寸大，营养物质在腹腔内的扩散不理想，阻碍了ALG微囊向大型动物和人类应用的转化。因此，近年来的研究旨在降低包膜厚度增加营养物质供应，同时维持被包封胰岛的免疫保护能力[35]。Weaver等[26]开发了一种微流控封装系统，该系统可合成直径较小的PEG微囊。相较于ALG微囊，PEG微囊可更好地改善封装胰岛的胰岛素反应性，并允许在血管化的组织空间移植，减少移植胰岛的质量和体积。通过血管生成载体将PEG包裹的胰岛移植到一个孤立的、可回收的、高度血管化的部位，证明单个胰腺供体的同基因胰岛块比传统的ALG微囊具有更好的长期功能，并可与移植部位的血管系统紧密结合。有研究人员设计了非球形微囊化胰岛样微组织，并研究了几何形状对细胞活力的影响。发现与相同体积的杆状和球状微组织相比，环状微组织具有更强的细胞活力和代谢活性，且环状微组织可以维持大鼠胰岛素瘤细胞特有的葡萄糖反应性和胰岛素分泌能力。此外，环状微组织在微囊化后，可保持几何形状和结构完整性[36]。

重建天然ECM可改善胰岛周围微环境，减少微囊内细胞死亡。ECM由胶原蛋白、弹性蛋白、层粘连蛋白、透明质酸等组成，可介导细胞间、细胞与基质间的相互作用，为细胞提供生理和机械支持。经典ALG微囊提供的环境并不能模拟天然的ECM，胰岛的生存会受到影响。一些ECM分子，如层粘连蛋白、Ⅰ型胶原蛋白或Ⅳ型胶原蛋白，可与ALG结合获得新的包封材料，促进微囊化细胞的生存能力并减少细胞凋亡。透明质酸是胰腺ECM的主要成分之一，与细胞黏附和活力变化有关。有实验证明ALG和透明质酸混合微囊可提高被封装胰岛的活力，减少早期凋亡和膜损伤，保持稳定的胰岛素分泌功能，且不改变对葡萄糖刺激的反应[37]。有团队研究出了一种基于ALG和ECM水凝胶复合材料互穿网络的新型仿生胰岛微囊材料，其可增强细胞与基质的相互作用，提高胰岛细胞生长能力[38]。但无血管移植可能导致胰岛活力丧失，其临床应用仍需进一步的完善与验证。

2 干细胞在微囊化胰岛移植中的应用

供者短缺阻碍了胰岛移植在全球范围内的应用[38]。干细胞是一类既有自我更新能力，又有多分化潜能的细胞。间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）和hPSC的应用可缓解胰岛细胞来源不足的问题，其与微囊化技术的结合将有望进一步提高胰岛移植的疗效。

2.1 间充质干细胞

MSC是目前研究最多的干细胞，既可作为支持细胞保护现有的β细胞，又可作为新生β细胞的来源，如果其能够完全分化成胰岛素分泌细胞（insulinproducing cell，IPC），就可改善移植胰岛的缺乏问题[27]。Cañibano-hernández等[39]已在三维 ALG 基质中完成了不同来源MSC向IPC的分化，发现与未分化的MSC相比，从胰腺来源的MSC分化的细胞产量最多。此外，ALG微囊基质中添加透明质酸可增加IPC的胰岛素释放。Jara等[40]发现从人体脂肪组织中提取的脂肪MSC可在体外有效分化为IPC和胰高血糖素分泌细胞（glucagon producing cell，GPC），将IPC、GPC聚集体用海藻酸钠聚合物微凝胶进行微囊化处理，再经Ba2+稳定后，微凝胶更加稳定，且对体外高葡萄糖和胰岛素分泌具有较好的反应性。

人脐带MSC（human umbilical cord MSC，hUCMSC）具有抗炎和免疫抑制的特性，人胰岛源性祖细 胞（human pancreatic islet-derived progenitor cell，hIDC）可去分化，随后再分化为IPC。Montanucci等[41]将海藻酸钠微囊化的hUC-MSC/hIDC共移植到非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷小鼠中，观察细胞产生和储存激素的能力，随后将其移植到新近发病的自发显性糖尿病小鼠中，发现小鼠血糖水平下降，表明hUC-MSC、hIDC可能协同促进胰岛素的产生，同时“冻结”自身免疫性疾病过程，逆转免疫性糖尿病小鼠的高血糖。为改善移植部位低血管密度及减轻强烈的炎症反应，有研究人员提出了一种名为CellSaics（一种三维结构，由MSC、新型生物可吸收材料、重组蛋白结合而成）的细胞移植技术，可增强血管诱导生成作用，并通过共移植增强胰岛移植效果[42]。与此同时，Mochizuki等[43]证实MSC CellSaics（由MSC和被称为MSC CellSaics的重组肽段组成的镶嵌状聚集体）可促进血管生成因子及抗炎因子的释放，将共封装的MSC CellSaics和大鼠胰岛移植到糖尿病小鼠皮下，可促进血管生成因子分泌，增强胰岛移植疗效。MSC和由三肽Arg-Gly-Asp（RGD）组成的锚点对胰岛细胞具有保护作用。Laporte等[44]研究证实，富含MSC和RGD-G的ALG微囊可提高胰岛的体外存活率和功能。虽然MSC是异体细胞治疗最有前景的来源[45]，但其在T1DM中的应用仍有较大争议。到目前为止，无论是在体内还是在体外，都缺乏强有力的证据来支持MSC可以分化为功能性成熟细胞或胰岛样类器官的假设[27]。

2.2 人多能干细胞

hPSC是获得胰岛细胞的潜在来源，利用人胚胎干细胞（human embryonic stem cell，hESC）和人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cell，hiPSC）定向分化胰岛细胞已成为可能[46-48]。胚胎干细胞在体外培养中具有无限增殖、自我更新和多向分化的能力。近年来，已有研究成功地诱导胚胎干细胞分化为胰岛前体细胞[49]。在移植过程中，胰岛前体细胞可以进一步成熟为葡萄糖敏感的IPC，从而治疗T1DM[24]。已有研究使用微囊装置包裹hESC分化得到的成熟胰岛细胞，发现将其移植到小鼠体内，可改善小鼠血糖水平，还可在一定程度上避开免疫系统攻击[50-51]。

ALG微囊可促进hESC的存活和增殖，并在适当的条件下使其分化为内胚层细胞。微囊化技术可用于移植多能干细胞来源的细胞，这些细胞具有更强的激素合成能力和免疫保护特性[52]。一些临床试验也在进行中，美国ViaCyte公司开发了PEC-Encap、PECDirect等多个产品，PEC-Encap、PEC-Direct的核心都是PEC-01细胞（由hESC定向分化的胰腺内胚层祖细胞），植入体内后可分化为IPC，从而分泌胰岛素并调节血糖。已有研究证明PEC-Encap安全性和耐受性良好，可分化为IPC。2020年8月，ViaCyte公司签署了一项协议，将开发改良版PEC-Encap，有可能在无需使用免疫抑制剂的同时仍允许血管形成[27]。2021年2月，ViaCyte宣布启动针对T1DM患者的封装细胞疗法的2期研究，旨在评估ViaCyte封装细胞治疗候选药物（VC01-103）在T1DM患者中的安全性和有效性（NCT04678557）[1,53]。尽管hiPSC是hESC的潜在替代品，体外研究已证明hiPSC能够分化为胰岛β细胞[54]，但其分化为成熟胰岛内分泌细胞的能力尚未达到hESC的同等质量[27]。

干细胞替代疗法虽在一定程度上克服了胰岛来源不足的障碍，但仍存在排斥反应等问题[27]。一些免疫保护策略，如将hESC衍生的胰岛细胞与宏包封装置和微包封技术相结合等各种有关方案都需继续研究，来平衡免疫保护的必要性和血管化的需要。

3 小 结

综上所述，多种策略已被用于改善胰岛微囊化技术和提高胰岛移植后的存活率。增强微囊免疫隔离及保护作用，提高微囊化材料的生物相容性，选择合适的移植部位，强化氧气和营养物质的供应及干细胞和微囊化技术的联合应用等均可提高移植胰岛的性能。但微囊化胰岛移植的临床疗效仍有待观察，将何种策略与微囊结合才可建立一种简单安全有效的胰岛移植方法，还需进一步的深入研究。