m6ARNA甲基化在骨发育中的研究进展

崔帅帅 综述 杨晓红 审校(遵义医科大学附属口腔医院，贵州 遵义 563000)

骨稳态取决于成骨细胞的骨形成和破骨细胞的骨破坏的平衡。BMSCs是一种异质性的干细胞，可以从许多不同来源获得，并分化为中胚层类型谱系，包括成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞[1]。BMSCs广泛应用于干细胞移植、基因治疗、组织工程和免疫治疗等领域[2]。BMSCs通常从骨髓抽吸物中分离并表征其特征，无论是科学研究，还是临床目的，BMSCs都被认为是最有希望的骨再生细胞来源[3]。BMSCs具有向成骨谱系分化的高亲和力，其向成骨细胞分化是骨再生和修复过程中的关键步骤[4]，但同时BMSCs也有向脂肪细胞、软骨细胞分化等潜能。在衰老或其他病理刺激下，如激素紊乱等，BMSCs向脂肪细胞分化增多[5]，导致骨髓环境中脂肪组织过度堆积，骨微结构改变，骨骼脆性增加，骨折风险变大[6]。然而，BMSCs干细胞的谱系分配倾向于成脂或成骨谱系的明确机制尚不清楚。证据表明[7]，BMSCs的成骨分化与多种遗传因素密切相关，如信号分子、生长因子等，但近年来细胞分化的表观遗传调控机制越来越受到关注。最近的研究证据[8]表明，表观遗传修饰，如组蛋白乙酰化和DNA甲基化，参与了BMSCs在骨再生过程中的细胞分化过程。N6-甲基腺嘌呤(m6A)修饰作为表观遗传调控的另一层(RNA表观遗传学)，最近被报道在胚胎干细胞(ESCs)和各种癌细胞类型的细胞功能和分化中发挥重要作用[9]。然而，对于m6A修饰在BMSCs细胞分化中的作用知之甚少。鉴于m6A与健康和疾病的强烈相关性，学者们对于m6A在骨稳态中的潜在作用也做出了重要的探索，本文将对m6A在骨发育过程中的相关研究作一综述。

1 N6-甲基腺嘌呤(m6A)修饰概述

N6-甲基腺嘌呤(m6A)是最普遍的转录后内部mRNA修饰，参与多种生物过程的微调[10]。在哺乳动物中，m6A由甲基转移酶复合物(MTC)催化，该复合物由一个酶亚基甲基转移酶样3(METTL3)和一个底物识别亚基甲基转移酶样14(METTL14)和一个调节亚基Wilms肿瘤1相关蛋白(WTAP)等蛋白组成，多种蛋白质共同参与调节MTC的功能，从而使m6A甲基化能够高效、精准的调控细胞的生物学功能。MTC可以被去甲基酶脂肪与肥胖相关蛋白(FTO)和人类ALKB同系物5(ALKBH5)清除[11]，使m6A修饰成为动态可逆的过程。在分子水平上，m6A标记可以动态安装和从其被调控的转录本中移除，以调节RNA代谢，包括选择性剪接、RNA稳定性和翻译[12]。m6A发挥作用的主要机制是通过招募m6A结合蛋白，可以被含有YTH (YT521B同源性)结构域的蛋白识别，也可以被真核起始因子3 (eIF3)识别[13]，进而影响RNA的加工和表达。

2 m6A在成骨分化中的正向调控作用

一项研究[14]通过RNA测序证实，METTL3基因敲除后，大量受影响的基因与成骨分化和骨矿化相关，如Runx2、Osterix、ALP等。METTL3通过调节PI3K-Akt信号通路和VEGF的表达水平影响BMSCs的成骨分化。抑制METTL3可降低BMSCs成骨分化过程中Akt磷酸化、Vegfa及其选择性剪切的表达水平。G.Yan等[15]利用m6A RNA免疫沉淀(RIP)芯片发现pre-miR-320是BMSCs中METTL3靶基因中m6A甲基化最强烈的基因，在METTL3沉默后其甲基化显著降低。此外，他们进一步证明了RUNX2是miR-320的靶基因，而METTL3/m6A通过双重机制上调RUNX2的表达水平来实现成骨：(1) METTL3/m6A通过抑制pre-miR-320和miR-320上调RUNX2水平；(2)METTL3/m6A促进RUNX2 mRNA的直接甲基化，提高其表达水平和细胞稳定性。

3 m6A在成骨分化中的负向调控作用

然而，还有一些不同的声音。J.Yu等[16]研究发现METTL3正调控MYD88的表达，MYD88是NF-κB的扩散接受调节因子，随后激活NF-κB信号通路，而NF-κB信号通路被认为是成骨的抑制因子，从而负调控成骨。不过，这种倾向可以被去甲基化酶ALKBH5逆转。在另一项研究[17]中也证明了METTL3在体外和体内均抑制成骨过程，而这种作用是通过METTL3/ mir-712-5p/FGFR3轴实现的。具体来说，METTL3介导了miR-7212-5p水平的升高，miR-7212-5p通过靶向FGFR3抑制MC3T3-E1细胞的成骨细胞分化。此外，H.E.Son等[18]也首次证实了FTO通过诱导轻度内质网应激激活成骨分化的潜在机制，在C3H10T1/2细胞中，p-AMPK上调FTO的表达，FTO诱导AMPK磷酸化，FTO与p-AMPK之间存在正反馈回路；在机制上，m6A去甲基化酶FTO调控内质网应激基因启动子的去甲基化，从而刺激内质网应激，进而促进成骨分化。

4 m6A在成软骨分化中的作用

在原代软骨细胞单层培养中，软骨细胞发生脱分化，失去表型和形成软骨的能力。基于微阵列分析，B. Ma等[19]发现体外扩增的人类软骨细胞检测到总基因表达总体下降。DNA甲基化部分导致许多基因的表达下调。通过整合RNA-Seq和ERRBS数据集，软骨细胞肥大分化还伴随着体外DNA甲基化的变化。此外，在炎症条件下，在IL -1b处理的ATDC5细胞中METTL3 mRNA和m6A甲基化水平呈剂量依赖的方式上调。有趣的是，只有MELLT3的表达量增加，而其他调控因子的表达量未受显著影响。当METTL3沉默时，ECM通过降低MMP-13和Coll X的表达，上调Aggrecan和Coll II的表达来加速降解。这表明METLL3在介导炎性因子分泌、软骨细胞胶原合成和降解方面具有重要意义，并且有可能是骨关节炎的治疗靶点[20]。

5 m6A在成脂分化中的作用

就像“骨质流失就是脂肪增加”的观点一样，成骨的反义词是脂肪形成[21]。FTO是一种与人类肥胖有关的基因，它通过控制m6A水平和mRNA剪接来调控脂肪生成。X.Zhao等[22]证明m6A位点与SRSF1-和2-结合簇存在空间重叠，因此m6A修饰可以被视为一种新的外显子RNA剪接顺式调控信号。FTO通过调控m6A水平，从而控制SRSF2在剪接位点的结合，调节前脂肪细胞分化的RUNX1T1的选择性剪接。miRNA在调控BMSCs分化为特定谱系方面有很大的作用。MiR-149-3p通过直接靶向FTO调控BMSCs分化为脂肪细胞和成骨细胞的交替谱系，其在BMSCs中表达在成脂肪分化过程中降低，而在成骨分化过程中增加[23]。FTO可以通过调控下游信号通路m6A水平促进成脂分化。METTL3-YTHDF2介导的m6A甲基化通过靶向JAK1/STAT5/C/EBPβ通路抑制猪BMSCs脂肪形成过程[24]。FTO也能通过GDF11-FTO-PPAR轴调控BMSCs的命运，抑制成骨过程，促进BMSCs谱系向脂肪细胞转移[25]。

6 m6A在破骨细胞分化中的作用

破骨细胞是来源于造血前体细胞的大型多核细胞[26]。破骨细胞作为唯一的骨吸收细胞，在维持骨稳态和保持骨骼完整方面起着至关重要的作用。Lorenzo de la Rica等通过转录因子结合基序分析发现，在破骨细胞分化和融合过程中，关键功能通路和基因发生低甲基化和高甲基化[27]。破骨细胞诱导后m6A和METTL3的总表达增加，但FTO和ALKBH5的表达不增加。当Mettl3被敲除时，破骨细胞的大小增加，但骨吸收能力降低。从机制上讲，Mettl3抑制破骨细胞基因(Nfatc1、cFos、Ctsk、Acp5和Dcstamp)的表达，并失活RANKL诱导的MAPK、NF-κB和PI3K-AKT信号通路的磷酸化水平。相反，Atp6v0d2的表达增加，这是一个促进细胞-细胞融合和多核过程的融合相关基因，由于Mettl3和YTHDF2的缺失提高了Atp6v0d2 mRNA的稳定性[28]。这些发现阐明了RNA表观遗传调控破骨细胞发育的分子基础。

7 小结和展望

基因表达在转录、转录后、翻译和翻译后等不同层面受到密切控制。在BMSCs的一些转录本上发现了m6A甲基化，特别是那些编码发育调节因子的转录本，这些调节因子调控BMSCs分化为特定的谱系。m6A修饰与调控成脂分化的下游信号通路如PTH/PTH1r通路、PI3K/AKT通路、wnt/β-catenin通路等存在交叉，拓宽了干细胞分化的多层调控。另一方面，m6A调控因子(“编写器”、“擦除者”和“读取者”)也被ncRNA调控，例如miRNA 320、miRNA 149-3p和miRNA7212-5p，这些上游miRNA可能也是后续研究中有趣的候选miRNA。这种表观遗传机制可以决定BMSCs的命运，并为干细胞生物学中转录后水平基因调控网络提供了新的视角。然而BMSCs的临床应用效率有限，因为有可能分化成不需要的组织。因此，要成功利用BMSCs通过m6A调控产生中胚层谱系来治疗骨病，了解其分化为特定终末谱系的分子机制至关重要，这将是未来的研究重点。