白芷美白凝胶的制备及其体外透皮吸收

朱琪，程红稜，谭敏慧，王晓慧，曾立

(邵阳学院 药学院，湖南 邵阳，422000)

白芷为伞形科植物白芷或杭白芷的干燥根,具有美白、散风除湿、通窍止痛的功效[1]。白芷中主要成分为香豆素类化合物，其中欧前胡素可能是白芷发挥美白功效的活性成分之一[2]。现代医学研究证明，白芷能消除色素在组织中的过度堆积，能治疗黄褐斑、白癜风、痤疮等多种皮肤病[3]。白芷醇提物对酪氨酸酶有较好的抑制作用[4-5]。

凝胶剂具有缓释的特点，给药次数少、峰谷血药浓度波动小、安全、外观晶莹透亮，无油腻感，易清洗，使用方便，因此受到使用者们的喜爱。传统中药因成分复杂，剂量难以控制，可能会不同程度地影响制剂的透皮吸收从而降低药物疗效。

本试验将使用白芷醇提物为原料制备白芷凝胶，以乳膏为对照，在优化促渗剂的前提下制备白芷美白凝胶和乳膏。采用Franz扩散池，结合小鼠离体皮肤为透皮屏障，考察含不同促渗剂(2%丙二醇、2%月桂醇氮酮、2%薄荷醇)的凝胶和乳膏在规定时间内单位面积透皮吸收累积渗透量Q24的差异。

1 材料与方法

1.1 仪器

Spectrumlab 752Pro 紫外可见分光光度计；CP214 电子分析天平(奥豪斯(常州)有限公司)；ZTY智能透皮吸收试验仪TP2A(巩义市英峪予华仪器厂)；KQ-500B超声波清洗机 (昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药

白芷饮片(市售，购于邵阳市饮片厂)；欧前胡素对照品(济宁天之蓝生物科技有限公司，批号20190126)；卡波姆940(浙江一诺生物科技有限公司，批号20190312)；甲醇(天津市永大化学试剂有限公司，批号20180624)；三乙醇胺(西陇科学化工有限公司，批号20190324)；月桂醇氮酮(上海山浦化工有公司，批号20190422)；桉叶油(湖北康纯香料有限公司，批号20190122)；薄荷油(湖北康纯香料有限公司，批号20190302)；水为超纯水。

1.3 动物

SPF级KM小鼠，体重(20±2) g，购自湖南斯莱克景达试验动物有限公司，生产许可证号SCXK(湘)2019-0004。

1.4 方法

1.4.1 白芷中欧前胡素的提取

称取白芷饮片(60 ℃恒温干燥后碾成粉末，过40目筛)100 g，置于圆底烧瓶中，加入75%乙醇1 500 mL，超声(50 Hz，100 W)20 min，60 ℃～70 ℃回流提取30 min，趁热减压过滤，合并滤液，旋蒸至无醇味，继续浓缩至100 mL，即为白芷欧前胡素初提液，4 ℃保存备用[4]。

1.4.2 白芷凝胶和乳膏的制备

1.4.2.1 白芷凝胶的制备

称取卡波姆940 1.0 g，均匀分散于48 mL蒸馏水中，使其充分湿润后加入磷酸缓冲盐溶液(pH 6.8)4 mL，加入1 %尼泊金乙酯甲醇液作为防腐剂，加入2 %的月桂醇氢酮促渗剂，充分搅拌，三乙醇胺调整 pH 至 6.0～6.8，溶胀过夜，得到凝胶基质。取白芷欧前胡素初提液10 mL，加入75%乙醇溶液50 mL溶解。与凝胶基质等量混合得到凝胶。

1.4.2.2 乳膏的制备

取白芷欧前胡素初提液10 mL，按照乳剂的制备方法，做成O/W型乳膏100 g。

1.4.2.3 制备方法

1.4.2.3.1 色谱条件

以0.01 moL/L的盐酸甲醇溶液为空白对照，用标准溶液在紫外分光光度计上200～400 nm 处扫描，确定最大吸收波长。

1.4.2.3.2 标准曲线的绘制

精密称取欧前胡素对照品5 mg，配制成50 μg/mL标准溶液储备液100 mL。精密量取储备液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL用甲醇溶液稀释10倍，得到5～25 μg/mL五个浓度梯度标准溶液，甲醇溶液为空白，在最大吸收波长处分别测定吸收度A。以标准溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，线性回归后得到回归方程。

1.4.2.3.3 精密度试验

配制得到低、中、高浓度(5、10、25 μg/mL)的欧前胡素标准溶液，每个浓度1 d内重复测定3次，连续测定3 d，记录吸光度，计算日内、日间RSD。

1.4.2.3.4 加样回收率试验

移取准确配制的浓度一定的样品溶液1 mL，按50%、100%、150%的比例加入标准溶液，按照含量测定的方法，记录吸光度，计算回收率和RSD值。

1.4.2.3.5 含量测定

白芷欧前胡素初提液1 mL，稀释到标准溶液浓度范围内，记录稀释倍数，在最大吸收波处测量吸光度。按公式(1)计算白芷中欧前胡素的含量。

白芷中欧前胡素的含量=A×C×V

(1)

其中，A为吸光度；C为供试液的浓度；V为供试液定容后体积。

1.4.3 不同促渗剂对透皮吸收累积渗透量的影响

1.4.3.1 制备含不同促渗剂的凝胶

按1.4.2.3的制备方法分别制备4份凝胶50 g，其中1份为空白组，其余3份按试验要求分别取1.0 g月桂醇氮酮、1.0 g桉叶油、1.0 g薄荷油加到上述含药凝胶中，得到含有2%月桂醇氮酮、2%桉叶油、2%薄荷油3种不同促渗剂的凝胶。置于4 ℃保存备用。

1.4.3.2 离体皮肤的制备

小鼠断颈处死，用脱毛剂(硫化钠)对小鼠腹部进行脱毛处理，剪下小鼠腹部皮肤，剥离脂肪组织及乳液组织，不伤角质层，将皮肤用新鲜生理盐水冲洗干净，4 ℃保存备用[6]。

1.4.3.3 体外透皮吸收试验

用改良 Franz 扩散装置[6-7]，将小鼠皮肤固定在给药池与接受池之间，扩散池有效渗透面积为2.80 cm2，角质层面向供给室，真皮层面向接收室。称取样品剂1 g，置于给药池中，在大小相同的离体鼠皮上涂匀。将上下两室固定，恒温(37±0.5) ℃下持续搅拌，并分别于0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0、24.0、36.0 h后取2.0 mL接收液，同时补足同温、等体积接收液，接收液离心，取上清液微孔滤膜过滤，滤液按给定的色谱条件测定吸收度，按照公式(2)计算单位面积累积渗透量Q[8]。

(2)

其中,Cn为第n个取样点测得的药物浓度；V为接收池的体积;S为有效扩散面积。

单位面积累计渗透率K=[Q/m]×100%

其中，m为1 g凝胶中欧前胡素的量。

1.4.3.4 含不同促渗剂的凝胶透皮吸收累积渗透量的测定

取含不同促渗剂(丙二醇、薄荷醇、月桂醇氮酮，浓度均为2%)的凝胶，以不含促渗剂的凝胶为对照，考察不同促渗剂对美白有效成分经皮渗透的影响。

1.4.3.5 凝胶与乳膏体外透皮吸收累积渗透量比较

使用优选的促渗剂分别制备凝胶和乳剂，按照体外透皮吸收试验方法对凝胶和乳剂在不同时间内单位面积投皮吸收累积渗透量进行比较。

1.4.3.6 曲线拟合

使用OriginPro 8.0软件做Q-t的零级、一级、Higuchi模拟拟合，判断体外透皮吸收是否符合释药规律。

2 结果

2.1 标准曲线

按2.3.1之方法扫描得最大吸收波长为304 nm；欧前胡素标准溶液浓度在5～25 μg/mL范围内，线性回归方程为吸光度=0.043浓度+0.649 8，R2=0.999 1。

2.2 精密度试验结果

精密度试验结果见表1。日内RSD为0.27～0.48%，日间RSD为0.14%。

2.3 加样回收率试验结果

加样回收率试验结果见表2。平均回收率为100.66%～100.77%，RSD为0.06%～0.27%。

表2 加样回收率试验测定结果(n=3)

2.4 欧前胡素的含量测定

欧前胡素的含量测定结果见表3。欧前胡素初提液的含量为13.02 μg/mL，RSD为1.30%。

表3 欧前胡素初提液的含量测定(n=3)

2.5 不同促渗剂对透皮吸收累积渗透量的影响

不同促渗剂对透皮吸收累积渗透量的影响结果见图1。

图1 不同促渗剂单位面积体外透皮吸收累积渗透量比较

从图1可知，3种促渗剂对凝胶均有不同程度的促渗作用，其中,2%月桂醇氮酮的促渗效果最佳。

2.6 白芷凝胶与乳膏体外透皮吸收累积渗透量比较

优选2%的月桂醇氮酮作为凝胶与乳膏的促渗剂，并对凝胶与乳剂在不同时间内单位面积透皮吸收累积渗透量进行比较，结果见图2。

图2 不同时间内凝胶与乳膏单位面积透皮吸收累积渗透率

由图2可知，凝胶与乳膏透皮吸收均良好；前8 h，乳膏单位面积累计渗透率与凝胶单位面积累计渗透率基本平行，凝胶略高，说明两者的速释性能相似。8 h之后凝胶单位面积累计渗透率仍然处于逐步上升的趋势，凝胶单位面积累计渗透率由8 h处的55.83%逐步上升为36 h处的81.11%，36 h后没有继续考察，说明凝胶的缓释功效明显高于传统剂型乳膏。

2.7 曲线拟合结果

白芷美白凝胶的体外透皮吸收符合零级、一级释放规律，并与Higμchi方程高度拟合(表4)。

表4 白芷美白凝胶体外释放方程拟合结果

3 讨论

欧前胡素(C16H14O4)为线型呋喃香豆素类化合物，其结构中含有不稳定的双键(美白的主要活性成分)和内酯键，为热不稳定物质。超声辅助-乙醇提取的方法，由于提取时间短，最大程度地保护了化学物质，提高了欧前胡素的收得率。

卡波姆是含羧基的高分子聚合物，其性质不稳定，使用三乙醇胺调整pH近中性，被中和成羧基离子化后，由于负电荷的相互排斥作用，使分子链弥散伸展，相互连接形成空间网状结构，药物能填充在其网状结构中[9]，通过形成的凝胶层(储药库)控制药物的缓慢释放，起到延长作用时间的缓释效果。

经皮制剂的透皮吸收受生物因素、药物的理化因素、剂型因素的影响，使药物呈现个体、剂型等差异[10]。白芷美白凝胶中使用2%月桂醇氮酮作为促渗剂能在皮肤角质层与脂质相互作用下，使药物在角质层中的扩散阻力减少，流动性增强，缩短药物的起效时间，起到速效的作用。