Toll样受体在小儿轮状病毒肠炎伴心肌损害中的表达和意义

谷肖灵，陈音，李晓琳，彭文娟，刘京涛

轮状病毒是导致儿童秋季腹泻的主要病原体之一。轮状病毒肠炎是由A组轮状病毒引起的急性传染性消化道疾病。轮状病毒感染的临床表现通常为呕吐、腹泻、发热，同时伴有脱水、电解质紊乱和酸中毒等症状，还会累及其他器官如神经系统、呼吸系统以及心脏、肝脏等器官，严重者可发生心源性休克或猝死[1-2]。天然免疫在轮状病毒肠炎中发挥重要作用。Toll样受体蛋白(Toll-like receptors，TLR)是经典的模式识别受体家族，在天然免疫中发挥关键作用。单核细胞主要表达TLR2和TLR4，通过促进炎性细胞因子的生成参与机体非特异性免疫[3]。然而，外周血单核细胞中TLR2及TLR4和轮状病毒肠炎合并心肌损害的关系尚未有研究报道。本研究拟通过检测轮状病毒肠炎合并心肌损害患儿外周血单核细胞中TLR2及TLR4水平，分析其在诊断轮状病毒肠炎合并心肌损害患儿中的临床应用前景。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集2019年12月至2021年12月三门峡市中心医院收治的轮状病毒肠炎患儿50例为研究对象，其中25例合并伴心肌损害患儿为观察组，25例无心肌损害患儿为对照组。观察组中男10例，女15例；年龄0.7～1.8岁，平均(1.66±2.19)岁；对照组中男11例，女14例；年龄0.6～1.9岁，平均(1.21±0.46)岁。同期选取25例在我院健康体检儿童为健康组，其中男12例，女13例；年龄0.4～1.9岁，平均(1.14±0.45)岁。3组研究对象性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 诊断标准 参照《儿童轮状病毒胃肠炎预防诊疗专家共识(2020年版)》中轮状病毒肠炎的诊断标准[4]。心肌损伤诊断标准：(1)肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB,CK-MB)和心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)均增高；(2)CK-MB和cTnI有1项异常，行心电图、心脏彩超、心脏远达三位片等心脏器械检查，显示心电图以R波为主的2个或2个以上导联存在ST-T波改变，或心脏增大，或局限性运动减弱等[5]。

1.3 纳入标准 (1)符合轮状病毒肠炎的诊断标准；(2)年龄0～2岁；(3)该研究已获得三门峡市中心医院伦理委员会批准(2020-KY-0026)，所有患儿入组前家属均签署知情同意书。

1.4 排除标准 (1)合并肌肉疾病、中毒性脑病、脑炎、肝肾疾病、心律失常、心肌炎、先天性心脏病患儿；(2)存在先天性疾病患儿；(3)存在严重心力衰竭、休克患儿。

1.5 检测方法 入院时即抽取外周血5 mL，2.5 mL放置于抗凝管中并采用免疫荧光法检测C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)。另外2.5 mL放入含乙二胺乙酸的抗凝管内，离心后分离血浆和血细胞保存在-80 ℃冰箱。采用N-乙酰半胱氨酸法及酶联免疫吸附测定检测肌酸激酶(creatine kinase,CK)、CK-MB、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白细胞介素-8(interleukin,IL-8)、CRP、γ干扰素(interferon γ，INF-γ)浓度。采用乳酸法检测LDH。

1.6 外周血单核细胞采集 采集外周血5 mL，通过Ficoll Pague试剂盒(GE Healthcare Life Science)分离液获得单核细胞。

1.7 外周血单核细胞内的TLR2、TLR4检测 总RNA采用Trlzol法试剂盒(Invitrogen，15596-026)进行提取，根据说明反转录得到cDNA，采用实时荧光定量聚合酶链式反应检测外周血单核细胞中TLR2、TLR4的mRNA表达。TLR2 mRNA正向引物序列：5′-TTT GCT GGA CTT ACC TTC CTT G-3′，反向引物序列：5′-CAG TAT CTC GCA GTT CCA AAC A-3′；TLR4 mRNA正向引物序列：5′-TGG ATA CGT TTC CTT ATA AG-3′，反向引物序列：5′-GAA ATG GAG GCA CCC CTT C-3′。使用β-actin作为内参照。采用2-△△CT方法计算目的mRNA表达量。

1.8 流式细胞仪器检测外周血单核细胞中TLR2、TLR4蛋白的表达 将分离获得的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)采用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution,PBS)洗涤2次后用100 μL PBS悬浮细胞，分别加入PE小鼠组织相容性抗原-DR抗体(PE histocompatibility antigen DR,PE-HLA-DR)，FITC-葡聚糖偶联物(FITC-Lineage)，复合荧光蛋白7(phycoerythrin conjugated Cy7,PECy7)-TLR2/4各5 μL。将样本避光在室温孵育30 min后，放置于离心机中以1 000 r/min离心5 min(离心半径13.2 cm)后弃去上清液，加入无菌PBS重新悬浮细胞，将样本放置在流式细胞仪(美国BD)检测。

2 结果

2.1 3组心肌酶谱比较 观察组心肌酶类各项指标显著均高于对照组和健康组，差异有统计学意义(P<0.05)。对照组心肌酶类各项指标均高于健康组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 3组心肌酶谱比较

2.2 3组血清炎症因子比较 观察组炎症因子各项指标显著均高于对照组和健康组，差异有统计学意义(P<0.05)。对照组炎症因子各项指标均高于健康组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 3组血清炎症因子比较

2.3 3组外周血单核细胞中TLR2、TLR4基因表达比较 观察组患儿的外周血单核细胞中TLR2、TLR4基因表达均显著高于对照组和健康组，差异均有统计学意义(P<0.05)。对照组患儿的外周血单核细胞中TLR2、TLR4基因表达均高于健康组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 3组外周血单核细胞TLR mRNA比较

2.4 3组外周血单核细胞中TLR2、TLR4蛋白表达的比较 观察组患儿的外周血单核细胞中TLR2、TLR4基蛋白表达均显著高于对照组和健康组，差异均有统计学意义(P<0.05)。对照组患儿的外周血单核细胞中TLR2、TLR4蛋白表达均高于健康组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1，表4。

表4 3组外周血单核细胞TLR平均荧光强度比较

图1 外周血中单核细胞中TLR蛋白表达

3 讨论

轮状病毒是属呼肠狐病毒科的一种RNA病毒，分为A～G 7个组，其主要通过粪-口途径传播，也可通过水和食物传播。其中A组轮状病毒可致婴幼儿肠炎，B组轮状病毒与成人肠炎有关[6-7]。轮状病毒肠炎常见于6～24个月的婴幼儿，偶见于新生儿，其潜伏期通常为2～3 d。起病较急，最初症状多为发热，临床表现主要为腹泻、无黏液及脓血，排黄色水样便且量多，严重者可出现轻度至中度脱水症状，甚至导致死亡[8]。此外，30%～50%的患儿早期会出现呼吸道症状[9]。轮状病毒肠炎的发病机制目前尚不清楚，一些研究表明，轮状病毒肠炎主要由病毒侵入小肠引起，导致小肠绒毛萎缩和肿胀，以及固有层细胞增殖，导致小肠的分泌和吸收功能障碍，从而诱发腹泻[10]。

轮状病毒感染不仅导致患儿肠炎发作，还会损害其他器官，如神经系统、呼吸系统及肝肾等多个器官，并引发小儿病毒性心肌炎等[11]。轮状病毒已成为导致儿童病毒性心肌炎的主要病原体之一，文献报道轮状病毒感染时造成的严重腹泻会导致血液浓缩、脱水及酸中毒等，这些引起心肌不同程度的损伤，心肌损害发生率高达50%～70%[12]。心肌细胞酶广泛分布于全身，在骨骼肌和心肌中含量最高，心肌细胞膜防止心肌细胞酶外渗到血液中。当心肌受损时，心肌酶被释放到血液循环中，导致病例组血清LDH、AST、CK和CK-MB水平升高。CK-MB在心肌损伤早期迅速升高[13]。在本研究中发现，轮状病毒肠炎伴心肌损害患儿的血清AST、LDH、CK和CK-MB显著高于对照组和健康组。这些研究结果表明，轮状病毒肠炎患儿的心肌损伤可能与脱水引起的电解质紊乱和循环障碍有关。

单核-巨噬细胞作为重要的炎性细胞参与机体免疫应答，在特异性免疫应答中他们可分泌多种炎症趋化细胞因子参与免疫调节并介导炎性反应[14]。TLRs作为模式识别受体，是先天免疫和适应性免疫的前哨，在宿主天然免疫中发挥关键作用[15]。研究表明TLR2和TLR4介导先天性免疫应答，激活细胞内级联反应从而诱导炎性反应。有关于小儿轮状病毒感染后机体免疫应答机制的研究表明，在患儿体内发现了至少5种TLRs的高表达，他们通过激发TNF-α、IL-8、CRP、INF-γ等各种细胞因子的产生，启动并参与轮状病毒性腹泻患儿免疫反应及病理生理过程。研究报道，中药参苓白术散通过调节TLR4信号通路抑制轮状病毒肠炎[16]。我们前期已发表的研究发现，TLR2和TLR4的基因转录和翻译后蛋白水平在轮状病毒感染大鼠肠道上皮的表达上调，提示他们可能参与轮状病毒感染后肠炎的进展[17]。在该研究中我们发现，轮状病毒肠炎伴心肌损害患儿外周血单核细胞中TLR2和TLR4的基因和蛋白水平明显高于对照组和健康组。以上研究结果表明TLR2和TLR4在预测患儿轮状病毒肠炎伴心肌损害中具有一定临床应用前景。

综上所述，本研究发现轮状病毒肠炎患儿外周血单核细胞中TLR2和TLR4的基因和蛋白表达与心肌损害的发生、发展有关，采用心肌酶联合TLR2和TLR4水平协助评价有助于对提高心肌损害诊断的准确性，并减少漏诊率。