氢气防治缺血-再灌注损伤及其机制研究进展

李林，王晨晨，王岱君

（潍坊医学院人体解剖教研室，潍坊 261053）

作为宇宙中最古老和最丰富的分子，氢气（hydrogen，H2）在传统上被认为是一种生物惰性气体。1888年，Pilcher等为避免不必要的手术，将H2注入胃肠道定位内脏损伤[1]。此工作仅利用了H2的物理特性而未发现其生物医学效能。1975年初，Dole等报道在8个大气压下，将无毛白化病鳞状细胞癌小鼠暴露于97.5%H2和2.5%氧气的混合物中2周，发现肿瘤显著消退，至此H2的生物医学效能首次被发现[2]。2001年，Gharib等报告，吸入0.7 MPa H2对血吸虫病相关慢性肝炎具有治疗作用，并认为H2的抗炎作用可能是其具有清除羟基自由基（·OH）的能力[3]。2007年，Ohasawa等证实H2通过选择性减少PC12细胞中细胞毒性·OH起到抗氧化作用，且H2不会与其他具有生理作用活性氧（reactive oxygen species, ROS）发生反应[4]。至此，H2的生物医学效能才引起人们广泛关注。

1 氢气防治缺血-再灌注损伤

一定时间的缺血后血流再灌通，而发生更为严重的组织损伤被称为缺血-再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury, IRI）。目前研究发现H2对许多组织器官IRI都具有不同程度的保护作用。

1.1 心

心血管疾病的死亡率占所有疾病死亡率的1/3，其中缺血性心脏病在治疗过程常发生IRI。H2在防治心IRI中显示出巨大潜力。Yue等发现，富氢盐水（hydrogen-rich saline, HRS）可减轻心IRI，改善心功能[5]。Li等观察到富氢水（hydrogen-rich water, HRW）可通过多种信号通路调节心肌组织代谢失衡，保护心IRI[6]。Gao等和Pan等则认为H2可通过减轻内质网应激（endoplasmic reticulum stress, ERS）和下调自噬来保护心IRI，并可能与降低心肌组织中AMPK、mTOR、beclin1、LC3等表达有关[7,8]。为提高H2在血液和受损组织中生物利用度，He等开发超声可见H2递送系统，该系统可使H2浓度在常温常压下单位体积内大大提高[9]。

1.2 肝

肝移植、复杂肝切除和严重肝外伤手术中都可能发生IRI。肝IRI是一个连续有机过程，此过程可能会产生严重肝损伤并最终导致病人死亡[10]。

研究表明，通过药物或小分子激活细胞关键存活途径或抑制细胞凋亡坏死途径可能有助于降低肝手术或肝移植IRI[11]。另有研究发现，吸入低浓度(1%～3%) H2[12,13]及吸入高浓度（66.7%）H2[14]皆能保护肝IRI。肝脏IRI机制较为复杂，在很大程度上仍不清楚。在既往研究中，已发现线粒体功能障碍、ROS过量产生、钙超载和磷脂酶激活在肝脏IRI发病机制中可能起着重要作用[15]，具有抗氧化、抗炎和保护细胞活性的新型药物可能是保护肝免受IRI的候选药物[16]。近期大量研究发现H2确能通过抗氧化、抗炎等发挥对肝的保护作用[14,17]。此外有研究表明，H2可通过减轻ERS[18]、抑制凋亡[19]和减轻肝细胞自噬[20]来保护肝。由此可见，给予H2可能是一种对抗肝IRI的有前景的方法。

1.3 肺

肺IRI发生在各种临床条件下，例如肺移植、体外循环和再扩张性肺水肿等[21]。肺IRI是一种复杂的“无菌”炎症，涉及快速氧化应激和肺内所有细胞的后续反应，最终导致内皮和上皮屏障破坏，造成危及生命的肺水肿和气体交换障碍。先天免疫细胞在肺IRI中起主要作用，它们在再灌注时迅速激活，直接导致组织损伤，并通过产生促炎细胞因子和相关分子模式加重炎症[22]。目前，对于肺IRI尚未有十分有效的治疗方法。近期研究发现，H2可在体外选择性减少细胞毒性ROS，如·OH和过氧亚硝基阴离子（ONOO-），并且能在多种动物模型体内发挥治疗性抗氧化和抗炎作用[12]，如HRS能减弱肺IRI[23]，减轻肺水肿等[24]。另有研究表明，在肺移植中无论处于暖缺血[25]还是冷缺血阶段[26]，H2均可发挥保护作用。由此可见，HRS在肺IRI中具有一定的应用价值，值得进行深入研究。

1.4 肾

肾IRI通常由休克和各种外科手术引起，临床甚为常见[27，28]，寻找有效的防治方法非常必要。已有大鼠实验研究发现，HRS不但能减轻肾IRI[29,30]，而且还能促进IRI后肾功能恢复[30]，对老年大鼠肾IRI同样能发挥较好的保护作用[31]。除单纯H2给予方式外，H2和CO混合给予方式更能明显减少ROS并显着改善肾IRI[32]。为推进H2临床研究，Hosgood等在肾IRI临床前模型上应用H2，以观察H2对肾缺血-再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）的影响，结果发现H2并没能改善肾功能、减少氧化损伤或炎症[33]。目前看来，进一步确定H2能否用于临床治疗肾IRI还需进行大量研究。

1.5 神经系统

脑卒中是全球致残、致死率高的首要原因之一，80%～85%为缺血性脑卒中，H2作为一种神经保护剂被广泛应用于缺血性脑卒中IRI[34]。研究发现，高浓度（66.7%）H2可以降低I/R过程中的氧化应激（oxidative stress, OS）水平，保护神经细胞免受ROS侵害，改善神经功能，降低脑I/R后梗塞率[35,36]。Wu等对大鼠海马OGD/R损伤神经元研究发现，H2能保护线粒体功能发挥保护作用[37]。此外，H2还能通过上调Treg细胞数量[38]、抑制小胶质细胞活化[39]、促进HO-1表达[40]对脑IRI发挥保护作用。一项研究表明，在已有的60多项H2治疗多系统疾病的临床试验中，至少有10项涉及神经系统疾病[41]。另有研究表明，H2对周围神经系统的保护作用同样得到验证[42,43]。因此，H2在防治神经系统IRI中可能具有潜在应用价值。

1.6 骨骼肌

在游离组织移植和下肢动脉闭塞期间，骨骼肌中可能发生IRI[44]。肢体I/R可导致一系列再灌注后综合征[45]，如挤压综合征和筋膜室综合征等[46]。研究发现，H2可通过抗氧化、抗凋亡[47]、抗自噬[48]、调节iNOS mRNA及eNOS mRNA表达[49]等，减轻骨骼肌IRI。细胞钙和ROS的增加，在缺血期间即已开始，在再灌注时放大，被认为是再灌注损伤的主要介质[50]。目前，大部分研究都集中于H2抑制过量ROS而并未过多关注防止钙超载。大多H2防治骨骼肌IRI的基础研究还仅停留在有效阶段，并未过多涉及防治机制，相关机制研究还有待进一步加强。

2 氢气防治缺血-再灌注损伤的主要作用机制

H2对IRI的保护机制主要涉及到选择性抗氧化、抗炎、抗凋亡，另外还有抗细胞焦亡、改善微循环障碍、调节线粒体能量代谢、抑制细胞自噬及ERS等。

2.1 选择性抗氧化应激

OS是指机体在遭受各种有害刺激时，体内高活性分子如ROS等产生过多，形成的过量氧化物不能被机体及时清除，氧化和抗氧化系统失衡，从而导致组织损伤。ROS是真核细胞主要的内源性氧化剂之一，是有氧代谢、细胞呼吸以及宿主对感染和损伤反应等的副产物[51]。在病理状态下，氧化还原平衡的改变会导致ROS的产生增加，进而导致氧化损伤。因此，及时消除ROS是十分必要的[52]，有关H2防治IRI的研究大都集中于ROS。最初Osawa等在细胞和大鼠OS模型发现，H2可选择性还原·OH和ONOO-，H2且不会与其他具有生理作用ROS发生反应[4]。随后大量研究发现H2可以中和急性OS条件下的·OH，产生非常有效的抗氧化作用，改善IRI[17,20,53]。在应用抗氧化剂治疗时面临的最大挑战是如何使抗氧化剂达到适宜浓度，以针对ROS介导的病理状况进行精确的氧化还原调节[54]。由于分子量低，H2可以很容易扩散穿过细胞膜，迅速到达产生ROS的线粒体或存储遗传信息的细胞核，因此H2对于清除氧化自由基有着无可比拟的优势。目前，H2的防治分子靶标仍然不是很清楚，还需要进一步研究。

2.2 抗炎

炎症反应是一个常见病理生理过程，炎症发生时会释放炎症因子和激活免疫系统。在I/R发生时，炎症因子会被过度释放，从而对细胞及组织造成损伤。大量研究发现，H2可以抑制多种炎性细胞因子分泌及促炎因子基因表达[14]，也可以降低多种促炎细胞因子水平，例如趋化因子CCL2、白细胞介素-1β、白细胞介素-6和肿瘤坏死因子-α等[3,55,56]。IgE高亲和力受体（FcεRI）可引发下游一系列信号传导，导致肥大细胞脱颗粒、释放趋化因子和细胞因子等。研究发现，H2可通过减少FcεRI及其信号通路下游分子磷酸化，抑制IgE与FcεRI结合导致肥大细胞脱颗粒和白三烯等炎症介质释放[57]。此外，H2可以改善活化的小胶质细胞的积累，减轻炎症和重塑[58]。还有研究表明H2可以通过PINK1/Parkin介导自噬[59]、活化NF-κB及ERK1/2等[60]以减轻炎症，从而减少IRI。说明H2可能不仅是一种自由基清除剂，还能够通过调节某些信号通路发挥抗炎作用。

2.3 抗凋亡

细胞凋亡是由相关基因及其产物调控而发生的细胞自主性死亡，存在3种经典细胞凋亡信号传导途径：外源性（死亡受体）途径、内在性（线粒体）途径和内质网途径。凋亡过程涉及许多高效且特异的蛋白水解，其中半胱天冬酶（Caspase）起着重要的作用，尤其是Caspase-3可以作为凋亡相关信号通路的汇聚点[61]。Wang等将创伤性脊髓损伤（SCI）大鼠作为研究对象，观察到HRS处理可以逆转SCI中升高的caspase-3，减轻SCI中细胞凋亡[62]。B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）家族蛋白控制线粒体膜的通透性，介导内在性途径凋亡。Liu等的研究表明，HRS可通过调节Bcl-2/Bax，抑制细胞凋亡因子，促进抗凋亡因子，从而改善IRI，提高皮瓣存活率[63]。还有研究显示，HRW可能通过调节JAK2-STAT3信号通路[64]以抑制心I/R导致的细胞凋亡。上述研究皆表明H2确能通过抗凋亡减轻IRI。

除上述机制外，H2还可以通过调节线粒体能量代谢障碍、减轻ERS[18]、抑制细胞焦亡及自噬[37]等发挥抗IRI作用。

3 小结

上述研究表明H2确实有益于防治IRI，其机制也正逐步得以阐明。但H2防治IRI的机制十分复杂，仍需进行大量深入的研究，且迄今大多数研究仅限于基础研究阶段，临床研究有待进一步加强，以使H2能够得到更加广泛的应用。