重组蛋白PFKFB3 的表达、纯化及酶活测定

麦玮倩 郑慜成 周亚琪 刘志平 洪梅 许洁安

肿瘤细胞代谢的研究是近年肿瘤领域的研究热点之一［1,2］。研究发现大部分的肿瘤促进因子或抑制因子直接影响肿瘤细胞代谢分子。其中糖酵解分子的表达、活性及调控对肿瘤的发生、发展、转移、消退起着至关重要的作用［3,4］。在肿瘤细胞增殖过程中,糖酵解所涉及的分子,包括转运分子、关键酶及限速酶,都成为新的抗肿瘤药物靶点。相应的,以肿瘤细胞代谢为靶向的新药研发也成为当今新型抗肿瘤药物研发的主要方向之一。

6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-双磷酸酶(PFKFB)分子是目前受明显关注的影响肿瘤代谢的一组分子［5］。PFKFB 是控制果糖-2,6-二磷酸(F-2,6-BP)水平的家族性双功能酶［6］。这类酶的N 端能在F-6-P与ATP 存在的条件下合成F-2,6-BP。相反的,PFKFB也能在果糖-2,6-二磷酸酶C 端作用下催化上述反应的逆反应,即F-2,6-BP 水解为F-6-P 和无机正磷酸盐。在葡萄糖的代谢过程中,6-磷酸果糖-1-激酶(PFK-1)催化F-6-P 转变成果糖-1,6-二磷酸(F-1,6-BP)是关键的限速步骤。而PFKFB 的产物F-2,6-BP是PFK-1 最强的激活剂。因此,抑制PFKFB 的表达或活性进而降低F-2,6-BP 水平,可显著抑制PFK1 的活性,进而抑制细胞糖代谢,最终抑制细胞的增殖［7］。相应地,调节PFKFB 及F-2,6-BP 的水平可以抑制肿瘤的发生发展。

哺乳动物的PFKFB 有4 种异构体,其中PFKFB3是目前与肿瘤最相关的PFKFB 靶标［8,9］。PFKFB3 编码的6-磷酸果糖-2-激酶(PFK2)激酶活性较其磷酸酶活性高700 余倍,而由PFKFB1、2、4 编码的PFK2其激酶活性比其磷酸酶活性稍高或两者活性相当［6］。无论是实验性的离体及在体肿瘤生长,都需要PFKFB3存在［10,11］。很多来自人的肿瘤标本中,与其相邻近的正常细胞相比,肿瘤细胞中PFKFB3 的表达明显增高,这些肿瘤包括胶质瘤、乳腺癌、结肠癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌及卵巢癌等［12］。

本研究在大肠杆菌中表达了PFKFB3 并通过Ni 柱亲和层析和分子筛纯化得到高质量的重组蛋白,并测定其酶活性质,为人PFKFB3 功能研究和抑制剂开发奠定基础。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、质粒和试剂 原核表达载体pET-30b(+)、大肠杆菌(E.coli)DH5、E.coli BL21(DE3)菌株由本实验室保存,限制性内切酶购于Takara 公司,质粒提取试剂盒购于天根生化科技有限公司。氯化钠(NaCl,S7653),氢氧化钾(KOH,P5958),3-(N-吗啉)丙磺酸(MOPS,M1254),六水氯化镁(MgCl2·6H2O,M2670),焦磷酸钠(Na4P2O7,P8010),聚乙二醇6000(PEG6000,81255),聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100,T9284),二硫苏糖醇(DTT,D9163),苯甲基磺酰氟(PMSF,P7626),甘油(V900122),F-6-P(F3627),ATP(A26209),磷酸丙糖的异构化酶(TIM,T6258),甘油-3-磷酸脱氢酶(GDH,G6880),醛缩酶(Aldolase,A8811),还原型辅酶Ⅰ(NADH,N8129),IPTG、溶菌酶、考马斯亮蓝R250、卡那霉素(Kan)购于Sigma 公司。乙二胺四乙酸(EDTA,15575-038)购于invitrogen 公司,β-巯基乙醇(0482)、三羟甲基氨基甲烷(Tris,0497)购于AMRESCO 公司,牛血清白蛋白(BSA,126579)购于CALBIOCHEM 公司,胰蛋白胨(LP0042)、酵母浸出粉(LP0021)购于英国OXOID 公司,蛋白酶抑制剂(DI101-02)购于全式金公司,Bradford 蛋白质浓度测定试剂盒购于Bio-Rad 公司,其他试剂均为国产分析纯。

1.1.2 Luria-Bertani(LB)培养基 LB 培养基的配置：胰蛋白胨10 g/L,酵母浸出粉5 g/L,氯化钠10 g/L,加入1 L 双纯水溶解,高压灭菌20 min。固体培养基是在上述培养基中加入2 g/L 的琼脂。

1.1.3 PPi-PFK 参照Van 等［13］的报道,将土豆洗净去皮,称取100 g,加入300 ml 提取液(100 mmol/L Tris,1 mmol/L EDTA,5%甘油,7 mmol/Lβ-巯基乙醇,1 mmol/L PMSF,1×蛋白酶抑制剂,pH 值8.4),研磨,8层纱布过滤,4℃,30000 r/min离心30 min,留上清得粗提液,依次加入5%、10%、5% PEG6000,每次加入后搅拌溶解,冰浴30 min,4℃,30000 r/min,离心30 min,取上清液。分装于2 ml 离心管,4℃,14000 r/min,离心30 min,弃去上清,保留沉淀,此沉淀即为PPi-PFK。真空泵吸干离心管内的液体,-20℃保存。使用前用1 ml的提取液重悬溶解沉淀后,4℃,14000 r/min,离心20 min,取上清液,然后用考马斯亮蓝法法测量蛋白浓度。

1.2 方法

1.2.1 PFKFB3 表达载体的构建 以人PFKFB3 编码序列为模板,使用生物信息学方法优化设计PFKFB3的原核编码序列,增强其在原核生物中的表达效能。用合成方法获得优化后的全长编码序列,在其5'端及3'端分别插入NdeI 和XhoI 酶切位点,同时在5'端酶切位点加入6-His 表达标签序列,用于后续的蛋白纯化工作。在基因3'端添加终止密码子TAA。随后将该脱氧核糖核酸(DNA)片段经NdeI/XhoI 双酶切后,插入pET-30b(+)载体,经E.coli DH5 转化、筛选、扩增后获得重组质粒,经测序分析后获得阳性克隆pET-30b(+)-PFKFB3。

1.2.2 PFKFB3 的诱导表达 接种pET-30b(+)-PFKFB3 转化的E.coli BL21(DE3)单克隆于含有50 ml LB 液体培养基的250 ml 三角瓶中于37℃,180 r/min振荡培养过夜。次日将过夜培养物以1%的量接种于新的含有600 ml LB 液体培养基的2 L 三角瓶中,于37℃,180 r/min 培养至OD600 达到0.6～0.8,加入IPTG至终浓度25 μg/ml,于16℃,140 r/min 继续培养16 h。8500 r/min,4℃离心15 min 收集菌体沉淀。沉淀用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤2 次,每次洗后均以5000 r/min,4℃,离心30 min。1 g 菌体加入20 ml 裂解液(含200 μl PMSF,20 μl 蛋白酶抑制剂,8 μl β-巯基乙醇)。冰浴超声破碎菌体,设置超声波细胞破碎机为转5 s,停5 s,功率60%,运行1 h,35 000 r/min 离心后分别收集上清和沉淀。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)蛋白电泳,考马斯亮蓝R250 染色后观察结果。

1.2.3 PFKFB3 重组蛋白的纯化 先用含有10 mmol/L咪唑的PBS 10 ml 平衡Ni 柱,使之带有电荷,再封住Ni 柱底端。加入5 ml 含10 mmol/L 咪唑的PBS 使Ni柱重悬,将此重悬液加入到蛋白溶液中,4℃缓慢旋转30～60 min,使Ni 柱吸附His-PFKFB3 蛋白。然后倒入Ni 柱,使废液流出。然后依次用含20、50 mmol/L 咪唑的PBS 100 ml 洗清Ni 柱,收集滤液置于冰上。再依次用含200、500 mmol/L 咪唑的PBS 5 ml 洗脱Ni 柱,此时洗脱下来的蛋白为PFKFB3 蛋白,将经过Ni 亲和层析纯化后的蛋白,进一步经过分子筛再次进行纯化,纯化后保存于含1 mmol/L DTT 的PBS 中,考马斯亮蓝法测量其蛋白浓度。

1.2.4 PFKFB3 酶活测定 PPi-PFK 酶活分析方法通过测定NADH 在340 nm 处的损耗量和反应速率,来反映PFKFB3 的酶活性。此分析方法分为两步：第一步,F-6-P 和ATP 在PFKFB3 的作用下生成F-2,6-BP,反应液 组分如 下：50 μmol/L F-6-P,50 μmol/L ATP,2 mmol/L MgCl2,1 mmol/L DTT,2 nmol/L PFKFB3,MOPS-NaCl 缓冲液(40 mmol/L MOPS,150 mmol/L NaCl,100 μmol/L EDTA,0.01% Triton X-100,0.5 mg/ml BSA,pH 值7.5)补足到100 μl,在37℃下孵育60 min,10 μl 1 mol/L KOH 终止反应。第二步,测定NADH 的消耗量,其与第一步反应生成的F-2,6-BP 的量呈正相关,反应液组分如下：1 mmol/L F-6-P,0.7 U/ml Aldolase,0.45 U/ml GDH,0.6 U/ml TIM,2 mmol/L MgCl2,5 mmol/L DTT,0.2 mmol/L NADH,5 μg PPi-PFK,Tris-HCl 缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl,pH 值7.5)补足到150 μl,再加入2 μl 第一步反应液,最后加入3 μl 25 mmol/L Na4P2O7启动反应,并立即在酶标仪检测NADH 消耗速率。反应温度为37℃,测定间隔为30 s,检测波长为340 nm,运行时间为30 min,测得平均反应速度(Mean V)数值,用GraphPad Prism 软件计算PFKFB3 的Km 值。

2 结果

2.1 人PFKFB3 原核表达载体的构建 通过基因全合成的方法,得到了优化后的编码人PFKFB3 基因的全长DNA。随后,将该DNA 产物经NdeI 和XhoI 双酶切处理,连接至同样经过双酶切处理的载体质粒,经E.coli DH5 转化、筛选、扩增后,最终获得了用于原核表达的pET30b(+)-PFKFB3 质粒,经测序显示该质粒正确。

2.2 人PFKFB3 重组蛋白的诱导表达 诱导原核表达载体pET30b(+)-PFKFB3转化的E.coli BL21(DE3) 菌株。收集大量表达pET30b(+)-PFKFB3 的菌体,使用超声的方法破碎菌体。细菌裂解液沉淀经SDS-PAGE 电泳分析,裂解菌液沉淀在55～70 ku 处无明显的重组蛋白条带。见图1 泳道1。上清液经过Ni 亲和柱后,用含有20、50 mmol/L 咪唑的PBS 清洗液分别清洗柱子,SDS-PAGE 电泳检测表明20、50 mmol/L 咪唑的PBS清洗液可以去除大部分杂蛋白。见图1 泳道2～6。最后,用含有200、500 mmol/L 咪唑的PBS 洗脱液分别洗脱,SDS-PAGE 电泳检测表明200、500 mmol/L 咪唑的PBS洗脱液可以得到粗纯化后的重组蛋白PFKFB3。见图1泳道7～9。同时重组蛋白PFKFB3 的分子量理论值为58 ku,表明重组蛋白PFKFB3 可以以较高的纯度诱导表达。

2.3 人PFKFB3 重组蛋白的分离纯化 考虑到在35 ku 和80 ku 处仍有比较明显的蛋白杂带(图1 泳道7～9),因此,进一步通过分子筛对蛋白PFKFB3 进行纯化。蛋白丰度图谱结果表明,经分子筛纯化后,杂蛋白在PFKFB3 蛋白液中所占比例明显减少,提高了重组蛋白PFKFB3 的纯度。见图2。经过蛋白浓度测定,每升培养基可获得10～20 mg PFKFB3 重组蛋白。

图1 PFKFB3 经Ni 柱亲和层析纯化后的SDS-PAGE 电泳图

图2 PFKFB3 蛋白纯化后的蛋白丰度图谱

2.4 人PFKFB3 重组蛋白的酶活测定 PFKFB3 的酶活分析采用PPi-PFK 分析方法,其中PPi-PFK 即糖酵解的第二个限速酶PFK1,该酶提取于刚发芽的土豆,可在-20℃保存1 周,提取物为淡黄色(见图3 中2 号管),如果变成棕色,则PPi-PFK 酶活降低,需要重新制备(见图3 中1 号管)。

图3 PPi-PFK 的性状

PPi-PFK 分析方法通过测定NADH 在340 nm 处的损耗量和反应速率来反映经PFKFB3 产生的F-2,6-BP的多少,经PFKFB3 产生的F-2,6-BP 越多,NADH 的损耗量和反应速率越大。1～6 nmol/L PFKFB3 的第一步反应液梯度稀释与NADH 的平均反应速率显示出良好的线性关系。该结果提示,在此条件下,可以进行PFKFB3 酶活研究和PFKFB3 抑制剂筛选。见图4。

图4 PFKFB3 重组蛋白的酶活测定

Km 值是酶活研究中一个极为重要的数据,是酶促反应速度为最大速度1/2 时的底物浓度。PFKFB3 的底物有两个,即F-6-P 和ATP。为了测定其Km 值,以7 种浓度梯度的F-6-P 或ATP 作为底物,加入相同的PFKFB3 重组酶进行酶促反应。以底物浓度的倒数1/S为横坐标,以NADH 消耗速率的倒数1/V 为纵坐标,得到双倒数曲线如图5 所示,经米氏方程计算得出,PFKFB3 底物F-6-P 的Km 值为142.5 μmol/L。见图5a。PFKFB3 底物ATP 的Km 值为34.21 μmol/L。见图5b。

图5 PFKFB3 重组蛋白的F-6-P 和ATP 的Km 值测定

3 讨论

本研究构建了PFKFB3 的原核表达载体,通过大肠杆菌表达后,提取纯化PFKFB3 蛋白并对其酶性质进行了测定。首先,在感受态细胞BL21(DE3)中转入PFKFB3 原核质粒,经终浓度为25 μg/ml 的IPTG 诱导,在16℃培养细菌过夜,表达PFKFB3 重组蛋白。冰上超声破菌,离心收集蛋白,SDS-PAGE 电泳结果显示,重组蛋白PFKFB3 主要存在于上清中。通过Ni 柱亲和层析和分子筛纯化蛋白,蛋白丰度图谱结果显示,PFKFB3 蛋白经过Ni 柱亲和层析和分子筛纯化后,基本只有一个PFKFB3 的强吸收峰,纯化效果良好。应用考马斯亮蓝法测定PFKFB3 蛋白浓度为2～3 μg/μl,成功获得了较高纯度和浓度的PFKFB3 重组蛋白。进一步的PFKFB3 酶活研究表明,在50 μmol/L F-6-P 的条件下,测出PFKFB3 对ATP 的Km 值为34.21 μmol/L。在50 μmol/L ATP 的条件下,测出PFKFB3 对F-6-P 的Km 值为142.5 μmol/L。

PFKFB3 已在肿瘤细胞中进行了广泛的研究,最近几年,PFKFB3 的功能研究已经延伸到血管细胞和免疫细胞,与血管生成、肺动脉高压和脓毒血症等疾病密切相关［14-17］。另外,在抑制剂方面,小分子PFKFB3抑制剂3PO 被广泛应用,但研究表明,3PO 与PFKFB3无法形成共结晶,提示3PO 不通过PFKFB3 来降低细胞糖酵解［18］。而最新的PFKFB3 抑制剂AZ 系列,如AZ26,其细胞半抑制浓度(IC50)低至0.281 μmol/L,但AZ26 在整体动物中的安全性评估还未见报道［18］。因此,重组蛋白PFKFB3 的成功获得,可以为PFKFB3 结构和功能的进一步研究及抑制剂的筛选提供材料并奠定基础。