中药复方干预TLR4/NF-κB相关通路治疗溃疡性结肠炎的研究进展

黄星星，任晓芳，张聪伟，梁艳妮，刘金响，史 英

(1. 陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046；2. 陕西中医药大学附属医院，陕西 咸阳 712000；3. 陕西中医药大学第二附属医院，陕西 咸阳 712000)

Toll样受体(TLRs)是一种可以特异性识别病原微生物中的病原相关分子模式(pathogen-associatedmolecular patterns,PAMPs)的受体，是近年来发现的一种模式识别受体，目前在人体中共发现11种，可以识别外源性微生物和内源性有害物质，并通过抗原抗体反应，清除微生物或有害物质[1]。正常情况下，当TLRs被激活后，通过相关信号通路，调控下游蛋白的表达，介导相应的免疫应答，抵抗或清除病原体，保护脏器组织[2]；但当免疫应答反应过于强烈时，下游蛋白释放的促炎因子会持续性释放炎性因子，造成各种慢性炎症性损伤，这种损伤广泛存在于各脏腑组织，溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)的发病与这种正向调控的免疫反应密切相关[3-4]。因此，根据TLRs介导免疫反应的机制，可以通过干预相关信号通路，抑制免疫应答，负向调控免疫反应，减少炎性因子的释放，起到治疗性作用[5-6]。近年来，由于中医药调控免疫应答治疗UC的研究不断深入，有多项研究表明中医药复方通过干预TLR4/核因子-κB(NF-κB)相关通路可以起到治疗UC的作用，但其作用机制阐述相对零散。TLR4/NF-κB作为其中的经典通路，在各种炎症性疾病的调控中起到重要作用。为探究中药复方对以上通路具体的影响机制，为以后的研究提供参考依据，遂对现有的研究进行总结。

1 TLR4/NF-κB与UC

1.1UC的发病机制 UC的发病机制尚不完全清楚，目前的研究表明其与感染、免疫因素密切相关[7-8]。当肠道感染，致病菌大量繁殖，肠道菌群失衡，细菌释放内毒素损伤肠道黏膜，肠道黏膜免疫屏障受损，诱发强烈的免疫反应，导致大量炎性因子释放，进一步加重肠道组织的损伤[8-9]。在近些年的研究发现，UC患者的肠道中存在大量的TLRs，其中以TLR4为主，而在正常人的肠道中，极少能检出TLRs[2，10]。这表明UC患者肠道的慢性炎症性损伤与TLRs介导的炎症反应有一定关联，其中TLR4相关通路介导的免疫炎症反应在肠道损伤中起到关键作用[3，6]。通过负向调控相关通路，抑制相关受体或蛋白的表达，可以起到减轻机体免疫反应，缓解肠道病理损伤的作用。

1.2TLR4/NF-κB相关通路 TLR4是TLRs家族中唯一具有4个转接分子，同时具备内源性配体和外源性配体，可以识别外源性感染和内源性有害物质，因此TLR4介导的相关炎症反应与UC的发病有密切联系[3-4]。TLR4介导炎症反应的相关信号通路主要有髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)依赖型通路和非MyD88依赖型通路2种[4]。其中MyD88依赖型通路，即TLR4/NF-κB相关通路，是目前研究最广泛的信号通路。其介导炎症反应的机制为：当TLR4与配体结合被激活后通过特定的结构域衔接蛋白招募并激活髓样分化因子MyD88，随后在IL-1受体相关激酶4的作用下，被激活的MyD88与IL-1受体相关激酶结合，促使IL-1受体相关激酶4与肿瘤坏死因子受体相关因子6生成复合物，该复合物通过特定的配体蛋白，磷酸化NF-κB抑制物(IκB)复合物， 使复合物分解，大量NF-κB从IκB/NF-κB的复合物中释放出来迁移到细胞核内表达，导致炎症反应的发生[3，11]。若TLR4/NF-κB信号通路中相关蛋白或因子异常表达，都可能导致免疫反应过于强烈或减弱，通过阻断相关蛋白或因子的表达，可以在一定程度上缓解肠道损伤。而临床中常用的多种中药复方制剂对UC有很好的治疗作用，相关研究表明其治疗机制与负向调控TLR4/NF-κB有关。

2 中药复方干预TLR4/NF-κB相关通路的机制

通过TLR4/NF-κB通路干预UC具体机制的研究中，研究较多的方剂有泄浊解毒方、乌梅丸、芍药汤、葛根芩连汤、泻心汤类、四神丸等，以及一些零散的方剂，如清肠汤、清肠化湿汤、参苓白术散等。在以往的研究中，已经总结报道了泄浊解毒方、乌梅丸、芍药汤、葛根芩连汤的治疗机制[12]。近年来无更新的研究或发现，因此本文主要总结叙述其他中药方剂及疗法如何影响相关通路，治疗UC。

2.1四神丸 四神丸由吴茱萸、补骨脂、肉豆蔻、五味子四味药物组成，主要用于治疗肾阳虚所致的UC。在蔺晓源等[13]的研究中，利用ELISA检测TLR4、转化生长因子β1(TGF-β1)、白细胞介素(IL)-10的含量，结果显示：以上指标与UC模型组的动物均有显著改善 ；而王燕等[14]利用PCR检测TLR4 mRNA的含量，结果显示四神丸干预组的试验动物结肠组织中的TLR4 mRNA含量显著低于其他组，表明四神丸可以抑制TLR4蛋白的表达，并抑制促炎因子，如TGF-β1、IL-6，IL-10的释放，缓解UC的肠道组织损伤，但在以上的研究中，并不能明确四神丸抑制TLR4相关通路的具体机制。为进一步探究，王爱华等[15]通过实时荧光定量PCR(Real-time PCR)、免疫组化、Western blot检测模型动物中TLR4, 白细胞介素-1受体相关激酶M(IRAK-M)mRNA以及蛋白的表达，结果显示，四神丸干预的动物，TLR4 mRNA和蛋白表达显著降低,IRAK-M mRNA和蛋白表达明显升高，并且实验动物结肠组织的损伤情况明显缓解。表明四神丸可通过增强IRAK-M的表达，稳定TLR4/MyD88复合物，减弱其信号传导，阻止下游复合物的形成，减少促炎因子的释放，负向调控TLR4介导的炎症反应，缓解炎症性损伤。

2.2泻心汤类 治疗UC的泻心汤类方包括甘草泻心汤、生姜泻心汤以及半夏泻心汤；泻心汤的组成主要为甘草、黄芩、半夏、大枣、黄连、人参，因药物用量及加减的不同，分别命名为不同的方剂，主要治疗作用均有辛开苦降、调和肠胃的作用。在赵增强[16]的研究中，采用半夏泻心汤干预UC大鼠，采用PCR扩增技术及Western blot检测结肠组织中NF-κB p65、IκB-α、TLR4 mRNA及蛋白的表达，结果表明：大鼠结肠组织中NF-κB p65、IκB-α、TLR4 mRNA及蛋白表达水平均显著降低，表明半夏泻心汤治疗可能通过阻断IκB-α的磷酸化，减少NF-κB的释放，使其无法顺利转录和表达，负向调控免疫反应治疗UC。在王俊丽等[17]的研究中，采用生姜泻心汤干预UC大鼠，仅检测了大鼠结肠组织内NF-κB、TLR4 mRNA的表达量及一些炎性因子，结果仅能表明生姜泻心汤可以间接抑制NF-κB、TLR4 mRNA的表达，对具体影响机制未做详细研究。在张建伟等[18]的研究中，分别检测结肠组织中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表达情况及TLR4、My D88、NF-κB p65 mRNA转录情况以及一些炎性因子的水平，结果显示：甘草泻心汤可以显著降低大鼠结肠组织TLR4、NF-κB p65、MyD88 mRNA的转录及相关蛋白的表达，说明甘草泻心汤可能通过阻断TLR4与My D88的结合，使得下游蛋白NF-κB无法表达，抑制免疫反应和炎性因子的释放。

2.3经验方类

2.3.1安肠汤及其类方 安肠汤及其类方主要有安肠汤、安肠愈疡汤、芍黄安肠汤，其中安肠汤的组成为补骨脂、黄芪、党参、白头翁、茯苓、槟榔、熟附子、地榆、赤芍、鸡内金、薏苡仁、干姜、白术、木香、延胡索、甘草，具有解毒除湿、扶正祛邪的作用。梁运特等[19]，分别检测各组大鼠结肠组织中TLR4、TNF受体关联因子6(TRAF6)、NF-κB蛋白的表达水平以及相关mRNA的转录水平，结果显示安肠汤干预组的大鼠结肠中，TLR4、TRAF6、TNF-α、NF-κB mRNA的转录水平及蛋白表达水平均显著下降，表明安肠汤可能通过抑制TRAF6的表达，阻断IκB的磷酸化，使得NF-κB无法从复合物中解离，降低其表达水平，负向调控免疫反应。安肠愈疡汤虽然可以降低TLR4的表达水平，但目前的研究尚不能明确表明其治疗机制。芍黄安肠汤的组成为黄连、炒白芍、黄芩、槟榔、厚朴、丹参、煨木香、赤石脂、甘草。李晨等[20]采用免疫组化技术检测NF-κB p65的表达情况，PCR技术检测TLR4及MyD88 mRNA的转录情况，结果显示：芍黄安肠汤干预组的大鼠结肠中TLR4、MyD88 mRNA、NF-κB p65的转录水平或蛋白表达水平均显著下降，表明芍黄安肠汤可以负向调控TLR4/NF-κB相关通路，调控的机制可能为芍黄安肠汤抑制了TLR4与MyD88形成复合体影响下游蛋白，因此抑制免疫反应，但具体影响机制尚不十分明确。

2.3.2清肠汤及其类方 清肠汤类经验方包含清肠汤、清肠化湿汤、清肠栓等。清肠汤的主要组成包括：白头翁、黄连、马齿苋、败酱草、黄柏炭、秦皮、焦白术、陈皮、木香、赤芍、甘草，主要功效包含清热解毒化湿。陈名涛等[21]以免疫组化法检测各组UC模型动物的结肠组织中的TLR4、NF-κB、NF-κB p65的表达情况，结果表明清肠汤干预的试验动物结肠组织中以上各蛋白的表达情况明显下降，可以表明清肠汤通过抑制TLR4的表达量，减少NF-κB的解离和表达，减少炎性因子释放可能是其治疗UC的机制；黄鹤等[22]检测了各组模型动物肠道菌群的变化，清肠汤治疗前后的肠道菌群明显趋于正常动物，表明清肠汤具有调节肠道菌群的作用。肠道菌群紊乱导致的致病菌繁殖，释放大量内毒素，激活TLR4导致下游蛋白表达，释放炎性因子加重肠道损伤，因此，清肠汤可通过调节肠道菌群抑制致病菌繁殖，减少内毒素释放，从而抑制TLR4的表达。清肠化湿汤包含黄连、黄芩、煨木香、炒白芍、生地榆、白芷、徐长卿、生甘草，主要功效包含清热解毒化湿。沈洪等[23]以体外培养HT-29细胞，以清肠化湿汤干预，结果表明其在体外可以抑制TLR4、NF-κB及炎性因子IL-8的释放。清肠栓为自研药物，药物组成未知。周岐鸣等[24]以清肠栓方药灌胃，并检测TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白的表达，结果显示清肠栓可以抑制以上蛋白的表达，并可以减轻结肠黏膜组织损伤,恢复腺体的正常排列,减少炎症细胞浸润,并显著下调血清和结肠组织炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β水平，起到治疗UC的作用。

3 讨 论

UC是一种慢性非特异性的肠道炎症，其发病与多种因素相关，免疫调控机制的失衡导致炎性因子持续性释放是其发病的重要原因[9]。正常情况下，机体会严格按照相关信号通路调控免疫反应，清除外源性感染源或内源性毒素，并保证免疫应答不会过于强烈；当严重感染导致机体内环境紊乱，或致病菌大量繁殖时，微生物或内毒素诱导的免疫应答过于强烈，原有的正向调控信号通路介导的免疫反应会促进大量的炎性因子释放，并持续性刺激组织器官，诱导各种急性或慢性炎症的发生[1，4，25]。

调节免疫应答和炎症反应的受体和信号通路有很多种，其中TLRs既可以识别外源性感染又可以识别内源性毒素，广泛存在于人体组织器官中，是识别感染和介导免疫反应的重要受体[1，26]。目前人体发现的TLRs共有11个，其中TLR4在UC患者的肠道中大量表达[10，27]，表明TLR4介导的炎症反应是造成UC患者肠道损伤的重要原因。因此，干预TLR4相关信号通路可以起到调控肠道炎症，减少炎性因子释放的作用。在TLR4介导的相关信号通路中，TLR4/NF-κB相关信号通路是机体免疫应答的经典通路，在其被激活后可调控下游蛋白NF-κB的表达,NF-κB调控表达的炎性因子主要有IL-1、IL-6、TNF-α、IL- 1β，因此负向调控以上通路可以减少炎性因子释放。

在中医药治疗方面，UC属于中医理论中“痢疾”的范畴，根据《中西医结合专家共识》[28]的建议，治疗方法包括清热解毒化湿、健脾益气温阳等，涉及的方药包括芍药汤加减、四神丸加减、参苓白术散加减等，中医药治疗的机制包括调节肠道菌群，稳定内环境，抑制关键蛋白表达，以减少炎性因子释放，促进肠道黏膜修复。

目前对UC治疗机制阐述相对明了的有“泄浊解毒方”和“安肠汤”，其可以调节肠道内环境，稳定肠道菌群，抑制致病菌的表达，减少内毒素的释放，从而减少外源性微生物及内源性毒素对TLR4的刺激和激活，减少TLR4的表达。TLR4表达量的减少，抑制IκB-α与NF-κB的复合物解离，使得NF-κB无法进入细胞核进行转录表达，使得细胞间黏附分子-1等炎性因子的释放减少，降低血管内皮细胞与炎性细胞之间的黏连程度，抑制内皮细胞发生活化，阻止炎性细胞肠黏膜浸润，防止发生局部免疫失衡[12，29]。而其他方剂多可以直接抑制TLR4、MyD88 mRNA、NF-κB p65及其蛋白的表达，从而抑制炎性因子的释放。并且四神丸可以阻断IRAK-M的表达，使得MyD88无法形成复合物激活下游蛋白，NF-κB的逆转录和表达受到影响，减少相关炎性因子的释放[15]，而半夏泻心汤则可以阻断IκB-α的磷酸化，使得NF-κB无法从复合物解离并转录和表达[16]。

经过对现有的中医药干预TLR4相关中药复方及逆行总结整理，乌梅丸及泻心汤类方药以辛开苦降法治疗UC，四神丸以温肾补阳为主要治法，芍黄安肠汤、泄浊解毒汤、清肠汤、清肠化湿汤均以清热解毒化湿为治法；安肠汤以健脾温肾、温阳化湿为主要治法；涉及的中医证型包括大肠湿热证、寒热错杂证、脾肾阳虚证、热毒炽盛证，以热证、实证居多，已有的研究总结发现Toll样受体介导的免疫反应与中医虚证有一定关联[30]，与中医热证是否存在一定的联系仍有待进一步研究。

UC的发病涉及多种机制，如自噬、氧化应激、炎症、凋亡等[31]，可以起到调控机制的信号通路复杂多样，TLR4/NF-κB作为免疫调控机制中较为经典的信号通路，可以为治疗UC的中药新药的研究提供一定的参考依据，但目前的中药复方研究中，大部分方剂的具体干预机制仍不够完善，尚需要进一步的研究探讨。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。