临床型乳房炎乳样中主要致病菌的分离鉴定及部分分离菌株的药物敏感性

胡 慧，李田美，姜艳芬

(西北农林科技大学 动物医学学院，陕西 杨凌 712100)

奶牛乳房炎是由理化因素刺激、微生物感染而引起的一种奶牛乳腺组织炎症，是造成全球重大经济损失的三大牛病之一，该病严重影响奶牛的健康和牛奶的品质，严重阻碍奶牛养殖行业和乳制品行业的发展[1-2]。病原微生物、环境因素和易感牛三者共同作用引起乳房炎，而病原微生物感染是最主要的原因。常见的引起奶牛乳房炎的致病菌有无乳链球菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、凝固酶阴性葡萄球菌等[3]。但因地域差异以及乳房炎防控水平的不断提高，引起奶牛乳房炎发病的优势菌群也有所变化。ZHANG等[4]对我国30个城市的125个奶牛场的研究结果表明，无乳链球菌在所有乳腺炎致病菌中占比最高(38.6%)；而另一项研究对我国161个大型奶牛场中采集的3 288份临床性乳房炎乳样中的病原菌的统计结果显示，主要致病菌为大肠埃希菌(14.4%)、克雷伯菌(13.0%)和凝固酶阴性葡萄球菌(11.3%)等环境致病菌[5]。目前，临床上对乳房炎的治疗仍以抗生素为主，广泛使用广谱抗生素使得治疗效果甚微的同时造成了药物残留以及致病菌株的耐药性增高[6]。因此，更好地了解奶牛乳房炎致病菌的分布对于选择适当的抗菌疗法和实施预防性管理策略非常重要。本试验拟通过采集陕西省部分地区奶牛场临床型乳房炎乳样，进行细菌的分离鉴定，了解引起乳房炎的主要致病菌及其耐药情况，为该地区奶牛乳房炎的防治提供科学依据，为临床用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器普通营养琼脂培养基、脑心浸出液肉汤培养基(BHI)、水解酪蛋白琼脂培养基(MH琼脂)、5%绵羊血琼脂平板，购自青岛科源生物科技公司；DL2000 DNA Marker，购自近岸蛋白质科技有限公司。PCR仪、生化培养箱，宁波江南仪器厂产品；厌氧培养箱，Baker Ruskinn公司产品；ThermoFisher Sensititire，Thermo Scientific公司产品。

1.2 样品采集2019年5月至2020年10月，分别在陕西省关中地区3个奶牛场采集临床型乳房炎乳样共126份，包括经抗生素治疗的18份。采样前先经消毒液喷淋乳房及腹部体表以清除污物，再用消毒毛巾(一牛一巾)擦拭乳房和乳头部位，弃去前3把乳，收集30 mL乳汁于灭菌试管中，置于冰盒中于6 h 内带回实验室。

1.3 细菌的分离纯化将乳样颠倒混匀，均匀涂抹于5%绵羊血血平板上，37℃培养24 h。分别选择不同形态特征的菌落经革兰染色观察细菌的形态后，再划线接种到BHI琼脂培养24～48 h。挑取经镜检确认纯化的菌落接种到BHI液体培养基，37℃、180 r/min过夜培养后划线，选取单菌落进行后续试验。整个细菌的分离纯化过程中同时将样品置于厌氧培养箱(80%N2,10%H2,10%CO2)进行培养。

1.4 16S rDNA鉴定以纯化的单菌落为模板进行16S rDNA PCR扩增，通用引物序列：27-F-5′-AGAG-TTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492-R-5′-T-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR扩增条件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 45 s，30个循环；72℃延伸10 min。取10 μL PCR扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳后用凝胶成像系统观察结果并拍照。扩增条带约为1 500 bp且符合测序标准的扩增产物送至北京擎科生物公司测序。测序结果在NCBI网站进行BLAST序列比对，确定细菌种属并保菌至-80℃冻存。

1.5 生化鉴定选择1.4鉴定的部分致病菌应用ThermoFisher Sensititire按照说明书步骤进行细菌的生化鉴定试验，革兰阳性菌使用GPID进行鉴定，革兰阴性菌使用GNID进行鉴定。细菌复苏后，挑取3～5个单个菌落经去离子水乳化混匀，用Sensititire浊度计调整至0.5 Mcfarland。分别吸取50 μL 细菌混悬液加至鉴定板中，GPID在1A、2A、9A孔接种细菌混悬液，GNID在1A、2A、5A、6A、9A、10A孔接种细菌悬液，接种完后立即加入液体石蜡覆盖。所有孔用封膜覆盖，H行的覆盖膜上须有孔，37℃培养18～24 h，Sensititire AutoReader读取结果。

1.6 药物敏感性检测分别选取10种抗菌药物对部分分离鉴定的细菌采用K-B法进行药物敏感性检测。严格按照美国临床和实验室标准协会(CLSI)和欧盟药敏试验标准(EUCAST)进行药敏试验和结果判定。

2 结果

2.1 16S rDNA测序从126份临床乳房炎乳样中共分离纯化细菌366株，纯化所得菌株16S rDNA PCR均有符合预期的1 492 bp条带(图1)。测序结果经BLAST与NCBI数据库序列比对，显示共分离纯化29个属的细菌，其中包括11个属的病原菌，占所有分离菌株的56.24%，其中分离到1株厌氧菌产气荚膜梭菌。3个场主要细菌阳性分离率如表1所示。3个场中葡萄球菌属、链球菌属、肠杆菌属、不动杆菌属、芽孢杆菌属和克雷伯菌属的样品阳性分离率较高，分别为30.94%(29/126)，22.22%(28/126)，21.43%(27/126)，16.67%(21/126)，15.87%(20/126)，7.14%(9/126)；其中，蜡样芽孢杆菌、产色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、乳房链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和黄体链球菌的分离率较高，分别为15.87%(20/126)，11.90%(15/126)，11.90%(15/126)，11.11.%(14/126)，6.35%(8/126)，5.56%(7/126)，4.76%(6/126)，4.76%(6/126)。

表1 主要细菌分离鉴定结果

M.DL2000 DNA Marker；1～13.分离菌株；14.ddH2O

2.1.1A场 共采集临床型乳房炎样品26份，共分离细菌60株，主要致病菌属有葡萄球菌属和链球菌属，样品阳性分离率分别为53.85%(14/26)和15.38%(4/26)；葡萄球菌属中产色葡萄球菌、马胃葡萄球菌、模仿葡萄球菌和溶血葡萄球菌的分离率分别为26.92%(7/26)，7.69%(2/26)，3.85%(1/26)，3.85%(1/26)；链球菌属中乳房链球菌的阳性分离率为15.38%(4/26)；此外，还分离出绿色气球菌、多杀性巴氏杆菌各1株。该场凝固酶阴性葡萄球菌和乳房链球菌感染为主，且存在着多种凝固酶阴性葡萄球菌的混合感染。

2.1.2B场 共采集的临床型乳房炎样品15份，共分离细菌52株，主要致病菌属为不动杆菌属、链球菌属、乳球菌属和葡萄球菌属，分离率分别为53.33%(8/15)，20.00%(3/15)，13.33%(2/15)，13.33%(2/15)，主要为约氏不动杆菌(40.00%)，乳房链球菌(13.33%)和格氏乳球菌(13.33%)。该场以约氏不动杆菌、乳房链球菌和格氏乳球菌感染为主。

2.1.3C场 共采集临床型乳房炎样品85份，其中包括经过抗菌药物治疗的18份。该场主要致病菌有肠杆菌属(27/85)、葡萄球菌属(25/85)、链球菌属(23/85)、芽孢杆菌属(20/85)和不动杆菌属(17/85)，以蜡样芽孢杆菌、鲍曼不动杆菌、产色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌感染为主，其分离率分别为23.53%(20/85)，17.65%(15/85)，9.41%(8/85)，9.41%(8/85)，8.24%(7/85)，7.06%(6/85)。67份未经治疗的样品中主要致病菌属为肠杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、不动杆菌属和芽孢杆菌属，其中鲍曼不动杆菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、黄体链球菌和大肠埃希菌的分离率较高，分别为22.39%(15/67)，19.40%(13/67)，11.94%(8/67)，10.45%(7/67)，8.96%(6/67)，8.96%(6/67)。经过治疗后的18份样品中，分离出的葡萄球菌属、肠杆菌属比例均有下降，而芽孢杆菌属以及克雷伯菌属的阳性分离率较未治疗的样品升高，蜡样芽孢杆菌、肺炎克雷伯菌、产色葡萄球菌和牛链球菌的阳性分离率分别为38.89%(7/18)，22.22%(4/18)，16.67%(3/18)，11.11%(2/18)。

2.2 生化鉴定按照GNID进行经过16S rDNA测序鉴定的肺炎克雷伯菌生化试验，应用GPID进行蜡样芽孢杆菌和产色葡萄球菌生化试验，结果显示蜡样芽孢杆菌能分解丙三醇、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、鼠李糖、精氨酸等，不能分解尿素、山梨醇、甘露醇；产色葡萄球菌能分解甘露醇、丙三醇、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖等，不能分解尿素和山梨醇；肺炎克雷伯菌能分解葡萄糖、麦芽糖、木糖、山梨醇、七叶苷、肌醇等，不能分解尿素、鸟氨酸、精氨酸。3种细菌生化鉴定结果均符合对应菌株生化特点，与16S rDNA测序结果相符。

2.3 药物敏感性检测分别选取5株蜡样芽孢杆菌、肺炎克雷伯菌和产色葡萄球菌分离菌株，采用纸片扩散法进行药敏试验。结果表明，5株肺炎克雷伯菌对氨苄西林均耐药，对氯霉素、诺氟沙星、卡那霉素、庆大霉素、头孢曲松、头孢他啶均敏感(图2A)；2019年11月样品有2株分离株分别对头孢呋辛、四环素中介，2020年7月样品有1株分离株对氧氟沙星中介，其余4株为敏感。5株产色葡萄球菌对10种抗菌药物均100%敏感(图2B)。5株蜡样芽孢杆菌对呋喃唑酮、卡那霉素、庆大霉素、青霉素均耐药；有1株对红霉素耐药，4株中介；1株对新霉素耐药，2株敏感，2株中介；5株均对环丙沙星、头孢拉定敏感；2株对四环素中介，3株敏感；5株对头孢哌酮中介(图2C)。

A.肺炎克雷伯菌；B.产色葡萄球菌；C.蜡样芽孢杆菌

3 讨论

全球奶牛乳房炎的发病率在25%～60%之间，国内大部分地区临床型奶牛乳房炎的检出率约为33.41%，隐性乳房炎检出率约为46.40%～86.70%，每年给全球奶牛业带来数十亿美元的经济损失[7-8]。目前，临床上治疗乳房炎最主要的措施仍然是抗生素治疗，但是长期不合理的使用抗生素，造成了环境中耐药菌株的产生并促进耐药基因的传播，人类和动物通过接触或食用被污染的食源性产品造成耐药基因在动物和人的微生物群落间扩散，威胁公共健康安全[9-11]。因此，明确乳房炎主要致病菌及其耐药谱对科学指导临床用药和减少耐药菌的产生具有重要意义。

本试验共采集了陕西省3个奶牛养殖场的126份乳房炎乳样，共分离出366株菌，葡萄球菌属、链球菌属、肠杆菌属、芽孢杆菌属、克雷伯菌属以及不动杆菌属的分离率较高。C场主要致病菌是葡萄球菌属、链球菌属、肠杆菌属和芽孢杆菌属，随着乳房炎感染周期的延长和季节的变化，致病菌种类增多，且存在着多种常见致病菌混合感染的情况。SONG等[12]收集了中国12个主要产奶省15个大型牛场1 153 份乳房炎奶样，分离到最常见的病原体是葡萄球菌(39.00%)、链球菌属(11.00%)、芽孢杆菌属(8.20%)、绿色气球菌(6.70%)和不动杆菌属(3.40%)，与本试验中病原体所占比例相似。

本试验中蜡样芽孢杆菌、产色葡萄球菌的分离率较高，而在经过头孢喹肟和头孢噻呋轮换用药治疗的乳房炎样品中，肺炎克雷伯菌的分离率达到27.78%，说明其对部分抗生素产生耐药。在本试验中产色葡萄球菌分离株对10种药物均敏感，而在我国其他地区，产色葡萄球菌已经出现了不同程度的耐药，且其能携带多种肠毒素基因，这些乳房炎源性葡萄球菌肠毒素基因的流行存在着地域相关性[13]，为奶制品安全带来巨大隐患。四川省凉山地区乳源性肺炎克雷伯菌对氨苄西林耐药率达到90.9%[14]。本试验中经过抗生素治疗的样品中分离的肺炎克雷伯菌对氨苄西林的耐药率达到100%，对头孢喹肟、头孢噻呋和氨苄西林耐药严重，可能与该场长期反复使用这些抗生素有关，该菌会造成持续性感染，短暂治愈后易形成反复感染，使用抗生素治疗往往达不到效果[15]。据报道，分离的蜡样芽孢杆菌对庆大霉素[16-17]、卡那霉素和环丙沙星高度敏感[18]。而本试验中该菌存在四重耐药的情况，说明关中地区乳源性蜡样芽孢杆菌的耐药情况较为严重，可能与不同地区不同奶牛场的用药习惯有关，提示临床上需要注意规范用药，避免抗生素的滥用。

本试验大部分分离株为环境性致病菌，金黄色葡萄球菌和无乳链球菌为接触性传染致病菌，主要存在于乳房内部，在泌乳动物的挤奶过程中传播；大肠杆菌、凝固酶阴性葡萄球菌、乳房链球菌、黄体链球菌、巴黎链球菌和克雷伯菌属环境性致病菌，广泛存在于环境中，可通过垫料、土壤、饮水以及挤奶器等相互传播。受到宿主或环境因素的影响，接触性传染致病菌和环境性病原菌可以相互转换，提示养殖场应加强饲养管理，保持畜舍环境和饮水卫生可有效降低乳房炎的发病率。本试验明确了关中地区部分奶牛场引起奶牛乳房炎的主要病原菌和部分分离菌株的药物敏感性情况，为乳房炎的防控和临床用药提供了科学依据。