基于JAK1/STAT3信号通路探讨寿胎丸含药血清对人绒毛膜滋养层细胞增殖、侵袭和迁移的影响

牟珍妮，申思楠，唐丽，刘莹蝶，周紫薇，雷磊

1.湖南中医药大学中西医结合学院，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙410021

复发性流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）是妊娠常见并发症之一，发病率约1%～5%[1]，其发病机制复杂，目前仍有40%～60%患者病因不明[2]，称为不明原因复发性流产（URSA）。虽然URSA确切病因仍不清楚，但一般认为绒毛外滋养层（extravillous trophoblast，EVT）细胞功能缺陷导致的螺旋动脉重塑受损是其病因之一[3]。EVT细胞增殖及向子宫蜕膜层和肌层血管进一步侵袭、迁移、分化，启动并完成血管重塑，是建立母胎循环的关键环节[4]。JAK1/STAT3信号通路参与细胞增殖、分化、免疫调节等重要生理过程[5]，是RSA发病重要的通路之一[6]。

寿胎丸出自《医学衷中参西录》，有补肾安胎作用。临床研究表明，寿胎丸联合西药治疗URSA临床效果显著优于单纯西药[7-8]。前期基础研究也表明，寿胎丸可通过调节RSA小鼠蜕膜蛋白及代谢物水平改善RSA 妊娠结局[9-11]。本研究以人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/Svneo为研究对象，从JAK1/STAT3通路探讨寿胎丸含药血清对HTR-8/Svneo细胞增殖、侵袭和迁移的影响，明确其治疗RSA的作用机制。

1 实验材料

1.1 动物和细胞

SPF级雌性SD大鼠16只，体质量220～250 g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号SCXK（湘）2019-0004。饲养于湖南中医药大学实验动物中心，温度（22±2）℃，湿度（50±5）%，自由饮食饮水，光照/黑暗周期12 h。本实验经湖南中医药大学动物伦理委员会批准（LL2021032501）。人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/Svneo，购于上海美湾生物科技有限公司，货号C1016。

1.2 药物及试剂

寿胎丸（炒菟丝子12 g，桑寄生6 g，续断6 g，阿胶6 g），饮片购自湖南中医药大学第一附属医院药剂科，经药剂科主任戴冰教授鉴定，符合2020年版《中华人民共和国药典》要求。采用水提醇沉法制备，浓缩成原药材浓度为2 g/mL。

胎牛血清、无血清非程序冻存液、RPMI1640培养基、青霉素-链霉素（双抗）、0.25%胰蛋白酶、PBS（武汉普诺赛科技有限公司，批号分别为164210-50、PB180438、PM150110、PB180120、PB180226、PB180327），CCK8试剂盒（上海碧云天生物生物技术有限公司，批号C0039），matrigel 基底膜胶（美国Corning公司，批号356234），0.1%结晶紫染色液（北京索莱宝科技有限公司，批号G1063），BCA蛋白浓度测定试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，批号E-BC-K318-M），RIPA裂解液（上海碧云天生物技术有限公司，批号P0013B），Janus激酶1（JAK1）、p-JAK1、信号转导和转录激活因子3（STAT3）、p-STAT3、Ki67、微染色体维持蛋白2（MCM2）、增殖核抗原（PCNA）抗体（美国Affinity Biosciences公司，批号分别为AF5012、AF2012、AF6294、AF3293、AF0198、AF0206、AF0239），血管内皮细胞生长因子受体（VEGFR）-2 抗体（英国Abcam 公司，批号ab39638），基质金属蛋白酶（MMP）-9 抗体、辣根过氧化物酶标记二抗（美国Proteintech，批号分别为10375-2-AP、SA00001-2），超纯总RNA 提取试剂盒（杭州新景生物试剂开发有限公司，批号5003050），cDNA反转录试剂盒、SYBR染料（苏州近岸蛋白质科技股份有限公司，批号分别为E047、E096）。

1.3 仪器

Series 8000 WJ 型CO2培养箱（美国Thermo Fisher Scientific公司），OSE-DB-02型加热型五段程控金属浴（北京天根生化科技有限公司），Gel Doc XR+凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司），Heraeus Fresco 17型超速冷冻离心机（美国Thermo Fisher Scientific 公司），Axio Vert.A1型倒置显微镜（德国Zeiss公司），Cytation3 型多功能酶标仪（美国Bio-Tek 公司），T100TMThermal Cycler型RT-PCR仪（美国Bio-Rad公司），Mini-PROTEAN Tetra型电泳槽、Mini Trans-Blot型转印槽（美国Bio-Rad公司），SW-CJ-1FD型超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）。

2 实验方法

2.1 含药血清制备

16只大鼠随机分为空白组和寿胎丸组，每组8只。寿胎丸组每日灌胃寿胎丸药液（2 g/mL）20.25 g/kg，空白组每日灌胃等量生理盐水，连续7 d。末次灌胃1 h后水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，腹主动脉无菌采血，3 000 r/min离心20 min，取上层血清，同组血清合并混匀，密封后置于56 ℃水浴锅灭活30 min。超净工作台内经0.22 μm无菌微孔滤膜过滤后，分装于1.5 mL无菌EP管，置于-80 ℃冰箱保存备用。

2.2 细胞培养

HTR-8/Svneo细胞用含10%胎牛血清、1%双抗的RPMI1640完全培养基置于37 ℃、5%CO2培养箱培养，2～3 d换液1次，当细胞融合至80%以上且细胞状态良好时，弃上清液，PBS清洗细胞2～3次，向培养皿中加入0.25%胰蛋白酶1 mL消化传代，继续培养。

2.3 细胞分组及存活率检测

取对数生长期HTR-8/Svneo细胞，胰蛋白酶消化后细胞计数板计数，调整细胞密度为5×104个/mL，接种于96孔板中，每孔100 μL，置于37 ℃、5%CO2培养箱培养24 h。弃去培养基，PBS清洗1～2次，将细胞分为对照组（10%空白血清）和寿胎丸低（2.5%寿胎丸含药血清+7.5%空白血清）、中（5%寿胎丸含药血清+5%空白血清）、高（10%寿胎丸含药血清）剂量组，每组5个复孔，分别加入提前配好的培养基，置于培养箱培养12、24、36 h。弃去培养基，加入CCK8反应液（RPMI1640培养基∶CCK8试剂=10∶1）110 μL，培养箱反应2 h，酶标仪波长450 nm检测各孔OD值，以只加培养基孔调零，计算存活率。存活率（%）=（实验组OD值-调零孔OD值）/（对照组OD值-调零孔OD值）×100%。

2.4 细胞划痕实验

将6孔板背面用马克笔划出3条对称横线，取对数生长期HTR-8/Svneo细胞，胰蛋白酶消化后细胞计数板计数，调整细胞密度为2.5×105个/mL，接种于6孔板，每孔2 mL，置于37 ℃、5%CO2培养箱培养，待细胞生长至80%左右时，每孔中央用1 mL枪头做垂直划痕，弃去培养基，PBS冲洗2～3次，按“2.3”项下方法分组，每组3个复孔，分别加入相应培养基，置于培养箱培养，分别在0、36 h拍照记录。用Image J 2x软件进行划痕宽度分析，计算划痕愈合率，评价各组细胞横向迁移能力。划痕愈合率（%）=（0 h划痕宽度-36 h划痕宽度）÷0 h划痕宽度×100%。

2.5 Transwell实验

2.5.1 纵向迁移能力

取对数生长期HTR-8/Svneo细胞，以5×105个/孔接种于6孔板，置于37 ℃、5%CO2培养箱培养24 h。按“2.3”项下方法分组，每组3个复孔，分别加入相应培养基培养36 h，胰蛋白酶消化细胞，用空白培养基重悬，调整细胞密度为2×105个/mL，每组取200 μL细胞悬液加至Transwell 上室，另将含10%胎牛血清的RPMI1640培养基500 μL加至下室，继续培养36 h。将细胞用4%多聚甲醛固定15 min，0.1%结晶紫染色20 min，显微镜下观察，随机选取3个视野对迁移细胞进行计数，计算细胞迁移率（实验组迁移细胞数÷对照组迁移细胞数×100%）。

2.5.2 侵袭能力

将基质胶于冰上融化，使用空白培养基将基质胶稀释8 倍，取50 μL 加入Transwell 上室，37 ℃凝固30 min，将细胞悬液加至铺有基质胶的上室中，其余操作步骤同“2.5.1”，计算细胞侵袭率（实验组侵袭细胞数÷对照组侵袭细胞数×100%）。

2.6 Western blot检测

细胞按“2.3”项下方法分组处理36 h后，弃去原培养基，PBS 冲洗1～2 次，用含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA 裂解液冰上裂解30 min，4 ℃、12 500 r/min离心15 min，取上清液，BCA法测定蛋白浓度，蛋白上样，凝胶电泳分离，湿转法转膜，5%脱脂奶粉封闭，TBST洗膜3次，分加入JAK1一抗（1∶2 000）、p-JAK1 一抗（1∶2 000）、STAT3 一抗（1∶2 000）、p-STAT3 一抗（1∶2 000）、Ki67 一抗（1∶2 000）、VEGFR-2 一抗（1∶750）、MMP-9 一抗（1∶3 000）、MCM2 一抗（1∶3 000）、PCNA 一抗（1∶3 000），4 ℃孵育过夜。TBST洗膜3次，滴加二抗（1∶10 000），37 ℃震荡孵育60 min，TBST洗膜3次，加ECL显色液显色，曝光并采集图像，用Image Lab软件分析蛋白灰度值。

2.7 RT-PCR检测

细胞按“2.3”项下方法分组处理36 h后，弃去原培养基，加入Trizol 提取总RNA，将RNA 反转录成cDNA，根据说明书进行PCR，反应条件：95 ℃、3 min；95 ℃、10 s，58 ℃、5 s，共40 个循环。以GAPDH为内参，2-ΔΔCt法计算目的基因表达量。引物序列见表1。

表1 各基因PCR引物序列

3 统计学方法

4 结果

4.1 寿胎丸含药血清对HTR-8/Svneo 细胞存活率的影响

培养12 h，与对照组和寿胎丸低剂量组比较，寿胎丸高剂量组细胞存活率显著升高（P<0.05）。培养24 h，与对照组比较，寿胎丸低、中、高剂量组细胞存活率均显著升高（P<0.05，P<0.01）；与寿胎丸低、中剂量组比较，寿胎丸高剂量组细胞存活率显著升高（P<0.01）。培养36 h，与对照组比较，寿胎丸低、中、高剂量组细胞存活率均显著升高（P<0.01）；与寿胎丸低剂量组比较，寿胎丸中、高剂量组细胞存活率显著升高（P<0.05，P<0.01）；与寿胎丸中剂量组比较，寿胎丸高剂量组细胞存活率显著升高（P<0.01）。见表2。培养36 h细胞存活率升高最明显，故后续实验选择36 h作为干预时间。

表2 各组HTR-8/Svneo细胞不同时点存活率比较（，%）

表2 各组HTR-8/Svneo细胞不同时点存活率比较（，%）

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与寿胎丸低剂量组比较，#P<0.05，##P<0.01；与寿胎丸中剂量组比较，▲▲P<0.01

4.2 寿胎丸含药血清对HTR-8/Svneo 细胞横向迁移能力的影响

与对照组比较，寿胎丸中、高剂量组细胞划痕愈合率显著升高（P<0.05，P<0.01）；与寿胎丸低剂量组比较，寿胎丸高剂量组细胞划痕愈合率显著升高（P<0.05）。见图1、表3。

图1 各组HTR-8/Svneo细胞划痕愈合情况（×100）

表3 各组HTR-8/Svneo细胞横向迁移能力比较（）

表3 各组HTR-8/Svneo细胞横向迁移能力比较（）

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与寿胎丸低剂量组比较，#P<0.05

4.3 寿胎丸含药血清对HTR-8/Svneo 细胞纵向迁移能力的影响

与对照组比较，寿胎丸低、中、高剂量组细胞迁移率显著升高（P<0.01）；与寿胎丸低、中剂量组比较，寿胎丸高剂量组细胞迁移率显著升高（P<0.01）。见图2、表4。

图2 各组HTR-8/Svneo细胞纵向迁移情况（结晶紫染色，×200）

表4 各组HTR-8/Svneo细胞迁移率比较（，%）

表4 各组HTR-8/Svneo细胞迁移率比较（，%）

注：与对照组比较，**P<0.01；与寿胎丸低剂量组比较，##P<0.01；与寿胎丸中剂量组比较，▲▲P<0.01

4.4 寿胎丸含药血清对HTR-8/Svneo 细胞侵袭能力的影响

与对照组比较，寿胎丸低、中、高剂量组细胞侵袭率显著升高（P<0.01）；与寿胎丸低、中剂量组比较，寿胎丸高剂量组细胞侵袭率显著升高（P<0.01）。见图3、表5。

图3 各组HTR-8/Svneo细胞侵袭情况（结晶紫染色，×200）

表5 各组HTR-8/Svneo细胞侵袭率比较（，%）

表5 各组HTR-8/Svneo细胞侵袭率比较（，%）

注：与对照组比较，**P<0.01；与寿胎丸低剂量组比较，##P<0.01；与寿胎丸中剂量组比较，▲▲P<0.01

4.5 寿胎丸含药血清对HTR-8/Svneo 细胞JAK1/STAT3通路蛋白表达的影响

与对照组比较，寿胎丸高剂量组细胞p-JAK1、p-STAT3蛋白表达显著升高（P<0.05）；与寿胎丸低剂量组比较，寿胎丸高剂量组细胞p-JAK1蛋白表达显著升高（P<0.05）。见图4、表6。

表6 各组HTR-8/Svneo细胞JAK1、p-JAK1、STAT3、p-STAT3蛋白表达比较（）

表6 各组HTR-8/Svneo细胞JAK1、p-JAK1、STAT3、p-STAT3蛋白表达比较（）

注：与对照组比较，*P<0.05；与寿胎丸低剂量组比较，#P<0.05

图4 各组HTR-8/Svneo细胞JAK1、p-JAK1、STAT3、p-STAT3蛋白免疫印迹

4.6 寿胎丸含药血清对HTR-8/Svneo 细胞增殖相关蛋白表达的影响

与对照组比较，寿胎丸中、高剂量组细胞Ki67、VEGFR-2、MMP-9、MCM2、PCNA蛋白表达显著升高，差异均有统计学意义（P<0.05，P<0.01）；与寿胎丸低剂量组比较，寿胎丸中剂量组细胞Ki67、VEGFR-2、MMP-9 蛋白表达显著升高，寿胎丸高剂量组细胞Ki67、VEGFR-2、MMP-9、MCM2、PCNA蛋白表达显著升高，差异均有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。见图5、表7。

图5 各组HTR-8/Svneo细胞Ki67、VEGFR-2、MMP-9、MCM2、PCNA蛋白免疫印迹

表7 各组HTR-8/Svneo细胞增殖相关蛋白表达比较（）

表7 各组HTR-8/Svneo细胞增殖相关蛋白表达比较（）

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与寿胎丸低剂量组比较，#P<0.05，##P<0.01

4.7 寿胎丸含药血清对HTR-8/Svneo细胞Ki67、增殖核抗原mRNA表达的影响

与对照组比较，寿胎丸低、中、高剂量组细胞Ki67、PCNA mRNA 表达显著升 高（P<0.05，P<0.01）；与寿胎丸低剂量组比较，寿胎丸中剂量组细胞Ki67 mRNA表达显著升高（P<0.05），寿胎丸高剂量组细胞Ki67、PCNA mRNA表达显著升高（P<0.01）；与寿胎丸中剂量组比较，寿胎丸高剂量组细胞Ki67、PCNAmRNA表达显著升高（P<0.01）。见表8。

表8 寿胎丸含药血清对HTR-8/Svneo细胞Ki67、PCNA mRNA表达的影响（）

表8 寿胎丸含药血清对HTR-8/Svneo细胞Ki67、PCNA mRNA表达的影响（）

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与寿胎丸低剂量组比较，#P<0.05，##P<0.01；与寿胎丸中剂量组比较，▲▲P<0.01

5 讨论

RSA属中医学“滑胎”范畴，首见于《叶氏女科证治》“妊娠有三月而堕者，有六七月而堕者，有屡孕屡堕者，由于气血不足，名曰滑胎”。中医学认为，滑胎由肾虚冲任虚衰、胎失所养，胎结不实所致，故常用补肾安胎法防治RSA[12]。作为补肾安胎代表方，寿胎丸一直沿用至今，临床疗效确切[13]。该方由炒菟丝子、桑寄生、续断、阿胶组成。菟丝子养阴通络，守而能走，补肾养精，益阴而固阳；桑寄生补肝肾，养血而固冲任，安胎；续断甘温助阳，补益肝肾，调理冲任，有固本安胎之功；阿胶补阴血，止血。四药合用，共奏补肾安胎功效。

人绒毛膜滋养层细胞来自外胚层，是母胎界面重要的调节细胞，在早期胚胎植入和免疫调节过程中发挥重要作用[14]。滋养细胞增殖、迁移和侵袭功能的正常发挥是螺旋动脉重构的必要条件，也是人类胚胎着床和胎盘形成的重要步骤。螺旋动脉重构是由血管内滋养细胞沿子宫螺旋动脉壁上游移动，取代内皮细胞并破坏肌层内膜，直接影响妊娠结局[15-16]。一旦滋养细胞功能发生障碍，可致子宫螺旋动脉重构受损，引发不良妊娠结局，包括妊娠丢失、先兆子痫、宫内生长受限及早产等[14，16]。本研究采用CCK8实验发现，HTR-8/Svneo细胞存活率随寿胎丸含药血清浓度升高而升高，且在干预36 h时效果最佳。故后续以36 h为干预时间，分别进行细胞划痕实验、Transwell迁移及侵袭实验。结果表明，随着寿胎丸含药血清浓度升高，HTR-8/Svneo细胞迁移、侵袭能力增强，说明寿胎丸含药血清在一定浓度范围内可提高HTR-8/Svneo细胞生理功能。

滋养细胞的侵袭是一个复杂过程，涉及基质细胞、腺体、动脉、巨噬细胞和蜕膜自然杀伤细胞的相互作用[17]。MMPs在滋养细胞侵袭子宫蜕膜的过程中发挥重要作用[18]。Plaks等[19]研究发现，MMP-9缺失小鼠胚胎植入后不久表现出滋养层分化和侵袭缺陷，以及宫内生长受限或胚胎死亡。本研究结果显示，随寿胎丸含药血清浓度升高，MMP-9蛋白表达也有所升高，推测寿胎丸含药血清可能通过上调MMP-9表达促进HTR-8/Svneo细胞侵袭能力。

Ki67、PCNA、MCM2是细胞增殖的分子标志物。血管内皮生长因子（VEGF）在胚胎发育的血管形成过程中起关键作用。VEGFR-2是一种在血管内皮细胞膜上表达的VEGFR[20]，其与VEGF 结合可促进细胞增殖，还可提高增强细胞迁移的整合素水平。本研究结果显示，Ki67、PCNA 蛋白和mRNA 表达及MCM2、VEGFR-2蛋白表达均随寿胎丸含药血清浓度增加而升高，提示寿胎丸含药血清可能通过上调Ki67、PCNA、MCM、VEGFR-2 等细胞增殖相关分子表达，促进HTR-8/Svneo细胞增殖和迁移能力。

JAK/STAT信号通路是参与细胞增殖、分化的重要信号通路之一。由接收信号的酪氨酸激酶相关受体、传递信号的酪氨酸激酶JAK 和产生效应的转录因子STAT三部分构成[21]。当多种细胞因子与受体结合后，可以激活JAK，磷酸化下游靶蛋白的酪氨酸残基，招募并磷酸化转录因子STAT，使其以二聚体的形式进入细胞核内与靶基因结合，调控转录输出信号，进而调节细胞增殖、分化、凋亡等过程[22]。研究表明，激活JAK/STAT 通路可促进肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移[23-24]。此外，JAK/STAT通路在胚胎着床中也发挥重要作用。STAT1和STAT3的磷酸化与胚胎植入密切相关[25]，敲除STAT3 基因的小鼠妊娠第7 日胚胎即死亡[26]。本研究结果显示，经寿胎丸含药血清处理后，细胞p-JAK1、p-STAT3蛋白表达升高，表明寿胎丸含药血清可激活JAK1/STAT3信号通路。

综上所述，寿胎丸含药血清能促进HTR-8/Svneo细胞增殖、侵袭和迁移能力，且呈浓度依赖性，其机制是通过激活JAK1/STAT3信号通路实现。本研究为寿胎丸治疗RSA提供实验依据，后期将继续在动物及临床研究层面深入挖掘寿胎丸治疗RSA的作用机制，以为经典名方的应用及推广提供参考。