基于UPLC-MS/MS多指标加权综合评分法优选百解合剂提取工艺

郑文炜，沈洋，许舒瑜，林锦德，褚克丹，许文，徐伟

1.福建中医药大学生物医药研发中心，福建 福州 350122；2.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122；3.中国人民解放军联勤保障部队第900医院，福建 福州 350002；4.安溪县中医院，福建 安溪362400

自2018年国家中医药管理局发布《古代经典名方目录（第一批）》以来，经典古方、现代临床经验方与民间验方向中药新药转化成为研究热点[1]。百解方是安溪县中医院在柴胡桂枝汤、龙骨牡蛎汤加减基础上，配伍厚朴、酸枣仁、合欢皮、紫苏梗研制而成的经验方，由柴胡、黄芩、白芍等9味药组成，临床主要用于肝之疏泄功能异常引起的焦虑、抑郁、失眠障碍等，具有疏解、理气、安神功效。百解方为传统水煎剂，存在煎煮费时、服用量不稳定、易变质等缺点[2]，为方便使用、减少服药剂量，拟将其改为合剂。

提取工艺研究是保证中药复方制剂临床疗效的重要环节，而评价指标的选择是工艺优化的关键，中药复方以中医药理论为指导，遵循“君臣佐使”配伍原则，因此，评价指标的选择应尽可能考虑“多成分”并与复方“君臣佐使”属性相联系。因中药复方成分复杂，采用传统色谱法进行多成分分析难度大、效率低。超高效液相色谱串联三重四级杆质谱法（UPLCMS/MS）因具有高灵敏度、高分辨率、高效等优点，已成为中药复杂体系的重要分析技术。为确保百解方经提取后能维持稳定的药效，本试验采用正交试验设计，以加水量、提取时间、提取次数为考察因素，以全方得膏率及方中各味药在2020年版《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）的13种指标性成分为评价指标，并建立UPLC-MS/MS同时测定13种成分含量的方法，结合主观与客观组合赋权法即G1-熵权法进行加权综合评分，优化百解方提取工艺，为该制剂的进一步开发利用与质量控制奠定基础。

1 仪器与试药

ACQUITYUPLCI-Class超高效液相色谱仪（美国Waters 公司），Xevo TQS 三重四极杆质谱仪（美国Waters公司），CPA225D十万分之一分析天平（德国Sartorius公司），KQ-500DE台式超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），Milli-Q 超纯水仪（美国Millipore公司），RV-10旋转蒸发仪（广州IKA有限公司），5810R离心机（德国Eppendorf公司）。

柴胡、黄芩、白芍、合欢皮、酸枣仁、紫苏梗、干姜、厚朴饮片，安徽聚草中药饮片有限公司，批号分别为200601、200301、200701、200522、200611、200512、190301、200321；甘草片，亳州市永刚饮片厂有限公司，批号200613。以上9味药经福建中医药大学药用植物实验室范世明高级实验师鉴定，符合2020年版《中国药典》（一部）规定，样本存放于福建中医药大学药学院标本室。对照品柴胡皂苷A（批号110777-201912）、柴胡皂苷D（批号110778-201912）、芍药苷（批号110736-201842）、黄芩苷（批号110715-201720）、(-)-丁香树脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷（批号111911-201804）、迷迭香酸（批号111871-201505）、酸枣仁皂苷A（批号110734-201914）、斯皮诺素（批号111869-202005）、和厚朴酚（批号110730-201915）、厚朴酚（批号110729-202015）、甘草苷（批号11610-201908）、甘草酸（批号110731-201619）、6-姜辣素（批号111833-202007），中国食品药品检定研究院。甲醇、乙腈、水（质谱纯，德国默克公司），甲酸（色谱纯，阿拉丁试剂上海有限公司），其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 指标成分含量测定

2.1.1 色谱与质谱条件

色谱条件：采用CORTECS C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.6 μm），流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0～2 min，20%A；2～4 min，20%A→60%A；4～5.5 min，60%A→84%A；5.5～5.6 min，84%A→90%A；5.6～7.0 min，20%A），流速0.25 mL/min，柱温45 ℃，进样量2 μL。

质谱条件：采用正负离子多反应监测（MRM）模式；毛细管电压3.50 kV；脱溶剂气氮气，体积流量800 L/h，温度500 ℃；锥孔气流N2为50 L/h，体积流量150 L/h；离子源温度150 ℃，二级锥孔萃取电压3.00 V，碰撞气为氩气。各成分质谱参数及来源见表1，色谱图见图1。

图1 百解合剂中13种成分UPLC-MS/MS色谱图

表1 百解合剂中13种成分质谱参数及来源

2.1.2 供试品溶液制备

称取百解合剂1/5处方量饮片共27 g，在设计的提取工艺条件下进行煎煮，将水煎液浓缩定容至250 mL，精密移取浓缩液1 mL于100 mL量瓶中，加入20%甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，10 000 r/min离心10 min，取上清液，用0.22 μm滤膜过滤，即得。

2.1.3 对照品溶液制备

精密称取芍药苷、斯皮诺素、甘草苷、(-)-丁香树脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷、迷迭香酸、黄芩苷、甘草酸、酸枣仁皂苷A、柴胡皂苷A、6-姜辣素、柴胡皂苷D、和厚朴酚、厚朴酚对照品，用甲醇溶解制备成浓度分别为1.397、0.741、1.468、0.847、0.457、2.538、1.606、0.187、1.049、0.566、0.359、0.254、0.360 mg/mL的单一对照品贮备液，精密量取适量，用20%甲醇稀释，得芍药苷、斯皮诺素、甘草苷、(-)-丁香树脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷、迷迭香酸、黄芩苷、甘草酸、酸枣仁皂苷A、柴胡皂苷A、6-姜辣素、柴胡皂苷D、和厚朴酚、厚朴酚混合对照品溶液，其浓度依次为27.94、1.482、5.872、2.118、2.285、126.9、32.12、0.374 0、5.245、11.32、0.898、2.540、3.600 μg/mL，稀释，制得不同浓度的混合对照品溶液。

2.1.4 线性关系考察

分别精密吸取“2.1.3”项下混合对照品溶液0.2、0.5、1、2、5、8、10 mL，置100 mL量瓶中，加20%甲醇定容至刻度，稀释配制为梯度浓度的混合溶液，按“2.1.1”项下条件进样测定。以峰面积对待测成分浓度进行线性回归，分别绘制标准曲线，得到回归方程和相关系数（r），并且逐一稀释分析物浓度，以信噪比S/N≈3为检测限、S/N≈10为定量限，结果见表2。

表2 13种成分线性关系考察结果

2.1.5 精密度试验

取“2.1.3”项下混合对照品溶液，按“2.1.1”项下条件1 d内连续进样6次及连续3 d重复进样（每日重复进样3次）测定，记录峰面积，分别计算峰面积比的RSD。结果13种成分日内精密度RSD为2.2%～3.9%，日间精密度RSD 为1.5%～3.9%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性试验

取“2.1.2”项下供试品溶液适量，于0、2、4、8、12、24 h按“2.1.1”项下条件进样测定，记录峰面积，计算RSD。结果13种成分RSD为2.5%～4.5%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.1.7 重复性试验

精密量取同一份提取浓缩液样品1 mL，按“2.1.2”项下方法平行制备6份，按“2.1.1”项下条件进样测定，记录峰面积，根据标准曲线计算各成分浓度，计算RSD。结果13种成分RSD为2.5%～4.1%，表明该方法重复性良好。

2.1.8 加样回收率试验

精密吸取6份“2.1.7”项下已知含量的百解合剂水煎浓缩液样品0.5 mL，按重复性试验含量结果近似1∶1比例分别加入13种成分对照品，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下条件进样测定，记录峰面积，代入标准曲线，计算待测成分含量，计算回收率及RSD，结果见表3。

表3 13种成分加样回收率试验（n=6）

2.1.9 样品测定

取“2.1.2”项下供试品溶液，按“2.1.1”项下条件进样分析，记录13 种成分色谱峰面积，分别代入“2.1.4”项下回归方程计算各成分浓度，并计算其在百解合剂处方量中的含量。

2.2 饮片中指标成分含量测定

分别取柴胡、黄芩、白芍、合欢皮、酸枣仁、紫苏梗、厚朴、干姜、甘草饮片，按2020年版《中国药典》各药含量测定项下的供试品溶液制备方法，用50%甲醇将提取液稀释适当倍数，按“2.1.1”项下条件测定13种成分含量，平行3份，结果柴胡皂苷A、柴胡皂苷D、黄芩苷、芍药苷、(-)-丁香树脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷、斯诺皮素、酸枣仁皂苷A、迷迭香酸、厚朴酚、和厚朴酚、甘草苷、甘草酸、6-姜辣素含量分别为3.326、0.227 4、111.3、16.27、0.882 0、1.045、0.387 0、2.905、12.28、4.946、8.438、32.85、10.73 mg/g，均符合药典规定，数据用于转移率的计算。

2.3 得膏率测定

精密吸取“2.1.2”项下提取液25 mL，经过滤离心后置于经恒重的蒸发皿中，70 ℃水浴浓缩至稠浸膏后于70 ℃真空干燥至恒重，在干燥器中冷却后迅速称定干膏质量，计算得膏率，得膏率（%）=[（干膏质量×提取液总体积）÷（25×饮片总质量）]×100%。

2.4 主客观法组合赋权

2.4.1 G1法主观赋权

确定各指标序关系，设rk为wk-1与wk的重要程度之比[3]，wk-1=rkwk，且(k=m,m-1,…,2)，计算权重系数wk，wk=。

2.4.2 熵权法客观赋权

首先对数据矩阵归一化，设m个评价指标，n个评价对象，rij=，且(i=1,2,…,n；j=1,2,…,m)；再求各指标熵值，fij=rij/，当（fij=0时，yijlnn=0）；k=1/lnn；sj=；最后计算各指标权重系数，wj=(1-sj)/[4]。

2.4.3 组合权重计算

设w1为G1法得到的主观权重值，w2为熵权法得到的客观权重值，wj为组合权重，则wj=w1jw2j/[5]。

2.5 正交试验优化水提工艺

在单因素试验基础上，确定饮片浸泡时间为2 h，正交试验以加水量（A）、提取时间（B）、提取次数（C）为考察因素，每因素3个水平，因素水平见表4，采用L9（34）正交表进行百解合剂水提工艺研究。

表4 百解合剂提取工艺正交试验因素与水平

根据复方“君臣佐使”配伍原则，结合方中各味药的指标成分含量与得膏率为评价指标，G1法权重评价标度分别为r2=1.5、r3=1.2、r4=1、r5=1.2、r6=1、r7=1、r8=1、r9=1.2、r10=1；各指标的顺序依次为：得膏率（X1，源于全方）>柴胡皂苷A、柴胡皂苷D（X2，二者含量之和源于君药柴胡）>黄芩苷（X3，源于臣药黄芩）=芍药苷（X4，源于臣药白芍）>(-)-丁香树脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷（X5，源于佐药合欢皮）=斯皮诺素、酸枣仁皂苷A（X6，二者含量之和源于佐药酸枣仁）=迷迭香酸（X7，源于佐药紫苏梗）=厚朴酚、和厚朴酚（X8，二者含量之和源于佐药厚朴）>甘草酸、甘草苷（X9，二者含量之和源于使药甘草）=6-姜辣素（X10，源于使药干姜）。按“2.4.1”项下G1法公式计算求得各评价指标的主观权重值（w1），利用正交试验不同条件下得到的数据在“2.4.2”项下熵权法计算得到各评价指标的客观赋权值（w2），由“2.4.3”项下公式计算得到各评价指标的组合权重（w3），结果见表5。按公式计算正交试验综合评分Pj，Pj=，结果见表6。采用SPSS26.0软件对综合评分进行方差分析，见表7。由直观分析可以看出，各因素对提取效果的影响依次为B>A>C，其中B3>B2>B1，A1>A2>A3，C2>C3>C1。根据方差分析可知，各因素在α=0.05水平对综合评分均无显著影响。故选取3个因素较高水平的组合B3A1C2作为最优提取工艺，即饮片加10倍量水，浸泡2 h，提取2次，每次2.5 h。

表5 百解合剂提取工艺评价指标权重

表6 百解合剂正交试验结果

表7 百解合剂正交试验方差分析

2.6 验证试验

取百解合剂2倍处方量饮片270 g，称取3份，编号1～3，采用优选的条件进行回流提取，测定得膏率及13种成分含量，按“2.2”项下含量计算转移率，结果见表8，表明工艺参数稳定性良好，该工艺可行。

表8 百解合剂提取工艺验证试验结果

3 讨论

百解合剂临床主要用于治疗因肝气郁结所致焦虑、抑郁、睡眠障碍。研究表明，柴胡皂苷A可抑制神经元细胞凋亡改善大鼠的抑郁样行为[6]，柴胡皂苷D能通过抗炎发挥抗抑郁作用[7]；芍药苷对小鼠具有明显的抗抑郁及神经保护作用[8]；黄芩苷具有抗焦虑作用[9]；(-)-丁香树脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷是合欢皮起抗焦虑作用的重要成分[10]；酸枣仁中皂苷类成分能抑制小鼠的中枢神经，减少小鼠抑郁行为次数，起到镇静催眠作用[11]；紫苏梗中的迷迭香酸能抗抑郁和抗焦虑；和厚朴酚与厚朴酚具有抗抑郁作用[12]；甘草苷能改善大鼠的精神状态与自主探索的能力[13]，甘草酸能有效地改善认知损害和睡眠障碍[14]；6-姜辣素也具有治疗失眠作用[15]；因此选择上述13种成分作为工艺优化的考察指标。

本研究采用G1-熵权混合加权法对评价指标进行权重分配，其中G1法为主观赋权法，评价人员可根据复方的配伍规律对各指标予以量化进行排序，计算得到各评价指标的主观权重系数，但因G1法主观性较强，常忽略客观数据的信息特点，所以结合客观赋权熵权法计算各评价指标的客观权重系数，最后经组合赋权得到组合权重系数，该法可使多指标评价权重赋值更加客观科学。

本研究在单因素试验考察药材饮片的浸泡时间、加水量、提取时间和提取次数基础上，以加水量、提取时间和提取次数三因素进行正交试验优化提取工艺，其中三因素顺序分别为10倍>12倍>15倍、2.5 h>2 h>1.5 h，2次>3次>1次。可能由于9次试验条件各不相同，随着溶剂用量与提取次数增加，所得提取液的体积增大，使制剂浓缩时间加长，导致某些成分被破坏，有文献报道柴胡皂苷A与柴胡皂苷D[16]、厚朴酚与和厚朴酚[17]、黄芩苷[18]、芍药苷[19]等在水煎液中热不稳定，易发生降解；另外，在中药复方提取过程中，“君臣佐使”配伍属性使药物成分在煎煮时存在动态变化，多次煎煮可能导致化学成分在水煎液中的溶出发生相互促进或抑制效应，如课题组研究发现天花粉对栝楼桂枝汤中芍药苷、甘草酸等9种成分在汤剂的溶出有影响[20]。

综上，本研究采用正交设计联合UPLC-MS/MS测定多指标综合评分法优选百解合剂的提取工艺，最终得到最佳提取工艺为饮片加10倍量水浸泡2 h，煎煮2次，每次2.5 h，该工艺稳定、可行，可为其制剂或新药开发提供依据。

致谢：本项目在福建省科技厅重点实验室、福建省中药资源研究与开发利用重点实验室完成。