酒醋盐炙丹参物性指标与脂溶性成分关联性分析

王梦珂，王梦伟，陈天朝，2

1.河南中医药大学药学院，河南 郑州 450008；2.河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州450000

丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎，始载于《神农本草经》，其味苦、性微寒，归心、肝经，具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痈等功效[1]，丹参含有水溶性成分（丹酚酸A、丹参茎叶总酚酸、丹酚酸B、迷迭香酸、丹参素等）、脂溶性成分（丹参酮ⅡA、丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、甲基丹参酮等），其中以丹参脂溶性成分为代表的主要有隐丹参酮、丹参酮ⅡA等，水溶性成分为原儿茶醛、丹酚酸B等[2]。有研究表明，以脂溶性成分丹参酮ⅡA为代表的丹参酮类成分对舒张血管、抗食道癌、抗炎、抗纤维化等方面有一定的药理作用[3-5]。隐丹参酮具有良好的抗乳腺癌、抗胃癌作用，毒副作用较小[6]。丹参经炮制后其内在成分与物性指标发生一定的变化[7]，主要变化为外观的形、色、气、味、质[8]。丹参常见的炮制方法有酒炙、醋炙、盐水炒、炒、米炒、炒炭及猪血制等[9]，最常见的是酒、醋、盐炙等。经课题组前期研究，选择具有代表性3种辅料酒、醋、盐，对其进行炮制研究。目前，中药饮片及制剂的质量控制大多关注化学成分含量及反映整体化学组成的色谱指纹图谱，鲜有关注其物理属性[10-11]。化学成分研究虽多，但评价指标较为单一，未能较全面反映饮片质量。

饮片的化学成分和物理属性共同影响着中药质量，中药饮片的质量控制需要综合研究物理属性与化学属性以及2类指标之间的相关性[12]。本试验从整体观念出发，对丹参的固有属性即物性指标和化学成分进行综合考察[13]，在研究多指标成分含量变化时，需确定内在成分指标的权重，采用主观赋权的层次分析法（AHP）和客观赋权的CRITIC法相结合对化学成分进行综合评分，以得到更具稳定性、可靠性的权重[14-15]。以物性指标（相对密度、pH值、吸水膨胀度、氧化值）与总黄酮、脂溶性成分丹参酮ⅡA和隐丹参酮的客观指标综合性评价酒醋盐炙丹参物性指标与脂溶性成分的相关性，以及不同炮制方法对丹参饮片的影响，为丹参炮制品饮片质量控制提供参考。

1 仪器与试药

UliMate3000 高效液相色谱仪（赛默飞公司），Thermo Evolution 201紫外可见光分光光度计（美国赛默飞），HK250科导台式超声波清洗仪器（上海汉克科学仪器有限公司），膨胀度测定管（郑州市金水区润华化玻仪器供应站），pFS-200p手压封口机（温州华珍机械有限公司），pHS-3C数字酸度计（上海雷磁仪器厂）。

丹参及酒、醋、盐丹参饮片，安徽普仁中药饮片有限公司，批号1804211，经河南中医药大学第一附属医院施钧瀚主任药师鉴定为唇形科鼠尾草属植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥块根及炮制加工品；对照品丹参酮ⅡA（批号Y20J8C40264，纯度≥98%）、隐丹参酮（批号H1208X45502，纯度≥98%），上海源叶生物科技有限公司；芦丁对照品（批号WDM3-201811，纯度≥98%），中国食品药品检定研究院。

2 方法与结果

2.1 总黄酮含量测定

2.1.1 供试品溶液制备

精确称取丹参及酒、醋、盐丹参细粉（过4号筛）2.0 g，置150 mL锥形瓶中，加70%甲醇60 mL，超声（频率50 kHz，功率250 W）处理50 min，提取45 min，重复2次。提取合并滤液，过滤，浓缩，加70%甲醇定容至25 mL容量瓶。吸取1 mL稀释后样液，置25 mL容量瓶中，70%甲醇稀释至刻度，摇匀，备用。

2.1.2 对照品溶液制备

精密称取130 ℃减压干燥至恒重的芦丁对照品5.0 mg，置于25 mL容量瓶中，加70%甲醇适量，水浴上微热溶解，放冷，加70%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.3 检测波长确定

取2 mL芦丁对照品溶液，进行显色处理，静置15 min，于400～800 nm可见光波长范围内进行扫描。结果在波长508 nm处有特征吸收峰，故确定508 nm为检测波长。

2.1.4 线性关系考察

精密吸取对照品溶液，进行显色处理。于波长508 nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，芦丁浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=16.554X-0.024 9（r=0.999 1），表明芦丁在0.012～0.036 mg/mL范围内线性关系良好。

2.1.5 精密度试验

精密吸取芦丁对照品溶液2.0 mL，按“2.1.3”项下方法，于波长508 nm处连续测定6次，计算RSD值，得RSD=0.28%，表明该仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性试验

精密吸取供试品溶液2.0 mL，按“2.1.3”项下方法，分别在10、20、30、40、50、60 min于波长508 nm处测定吸光度，计算RSD，得RSD=0.32%，表明该供试品在60 min内稳定性良好。

2.1.7 重复性试验

精密称取丹参细粉6份，按“2.1.1”项下方法平行处理，按“2.1.3”项下方法，于508 nm波长处测定，计算RSD，得RSD=0.46%，表明该方法重复性良好。

2.1.8 样品测定

丹参及酒、醋、盐丹参的总黄酮含量依次为3.93、4.02、4.40、3.37 mg/g。

2.2 丹参酮ⅡA、隐丹参酮含量测定

2.2.1 色谱条件

采用Agilent 反向色谱柱HC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.2%磷酸水（85∶15，V/V），流速1.0 mL/min，柱温25 ℃，检测波长270 nm，进样量10 μL。色谱图见图1。

图1 酒醋盐炙丹参的丹参酮ⅡA和隐丹参酮HPLC图

2.2.2 对照品溶液制备

精密称取丹参酮ⅡA 0.35 mg、隐丹参酮0.5 mg，置25 mL容量瓶中，以流动相定容至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液制备

精密称取丹参及酒、醋、盐丹参细粉1.00 g，加入流动相20 mL，超声（频率50 kHz，功率250 W）处理30 min，冷却至室温。称定质量，用纯水补足减失的质量，过0.45 μm针式微孔滤膜，即得。

2.2.4 线性关系考察

吸取“2.2.2”项下混合对照品溶液，用甲醇配成丹参酮ⅡA 浓度为0.35、0.7、1.4、2.8、4.2、7.0、8.4 μg/mL，隐丹参酮浓度为0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、10.0、12.0 μg/mL的对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件下分别进样测定，以峰面积为纵坐标，对照品浓度（μg/mL）为横坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程。丹参酮ⅡA为：Y=1.406 4X+0.076 9（r=1），表明丹参酮ⅡA在0.35～8.40 μg/mL范围内线性关系良好；隐丹参酮为：Y=1.111 6X+3.503（r=0.999 9），表明隐丹参酮在0.50～12.00 μg/mL范围内线性关系良好。

2.2.5 精密度试验

精密吸取隐丹参酮、丹参酮ⅡA的混合对照品溶液，重复进样6次，分别记录隐丹参酮和丹参酮ⅡA峰面积，计算RSD。计算得隐丹参酮、丹参酮ⅡA峰面积RSD分别为0.079%、0.12%，表明仪器精度性良好。

2.2.6 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液，分别于0、1、2、4、8、12、24 h，按“2.2.1”项下方法连续测定，记录峰面积，计算RSD。结果隐丹参酮、丹参酮ⅡA峰面积RSD分别为0.046%、0.09%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.7 重复性试验

精密称取丹参粉末（过4号筛）6份，按“2.2.3”项下方法制备得供试品溶液，并按“2.2.1”项下方法连续测定，分别记录隐丹参酮和丹参酮ⅡA峰面积，计算隐丹参酮、丹参酮ⅡA 质量分数的RSD 分别为1.57%、3.42%，表明该方法重复性良好。

2.2.8 加样回收率试验

精密称取0.5 g丹参粉末6份，分别置于具塞锥形瓶中，加入40 μg/mL隐丹参酮、丹参酮ⅡA对照品溶液1 mL，按“2.2.3”项下方法处理，按“2.2.1”项下色谱条件测定，记录峰面积，隐丹参酮、丹参酮ⅡA的平均回收率为96.66%、97.06%，RSD 分别为0.55%、0.92%。

2.2.9 样品含量测定

取丹参及酒、醋、盐丹参粉末1 g，按“2.2.3”项下方法制备，按“2.2.1”项下色谱条件测定，每批样品平行测定3次，取平均值。丹参及酒、醋、盐丹参的丹参酮ⅡA 含量依次为384.76、389.48、395.19、382.66 μg/g；丹参及酒、醋、盐丹参的隐丹参酮含量依次为241.5、245.84、249.24、230.77 μg/g。

2.3 物性指标测定

2.3.1 吸水膨胀度

分别称取丹参及酒、醋、盐丹参5.0 g，用量筒量取100 mL蒸馏水，各饮片分别与蒸馏水共置于50 mL锥形瓶中，分别于0、5、10、20、40 min及1、2、4、8、16、24 h，过滤出饮片，将锥形瓶中液体倒进量筒中读取体积，记录数据。选择上述饮片吸水饱和时对应时间，浸泡中药饮片，记录排开水体积差值，根据公式膨胀度（S）=膨胀后体积（V）÷饮片质量（W）计算各饮片膨胀度，平行测定3份，取平均值。

2.3.2 pH值

准确称取丹参及酒、醋、盐丹参约5.0 g，置于100 mL纯化水中，室温浸泡2 h，过滤并取滤液，用酸度计测定，记录相同温度的饮片pH值。

2.3.3 相对密度

称量丹参及酒、醋、盐丹参5.0 g，缓慢放入盛有50 mL液体石蜡的100 mL精密量筒中，待液体石蜡气泡排出完毕凹液面稳定时记录体积。相对密度（g/mL）=饮片质量（g）÷饮片体积（mL）。

2.3.4 氧化值

准确称取丹参及酒、醋、盐丹参约5.0 g，置于500 mL圆底烧瓶中，加水200 mL，混匀后蒸馏，精确收集前50 mL馏分。精密称取0.158 g的KMnO4，加纯水溶解并定容于500 mL 容量瓶内，配制成浓度为0.002 mol/L的KMnO4溶液，转移至棕色试剂瓶内保存备用。精密称取3.16 g的Na2S2O3，纯水溶解并定容于1 000 mL 容量瓶中，配制成浓度为0.02 mol/L 的Na2S2O3溶液，转移至棕色试剂瓶内，缓缓煮沸10 min，冷却，放置两周后滤过备用。取丹参不同炮制品饮片，用移液管准确量取5 mL馏分于滴定瓶内，加入H2SO4水溶液（硫酸∶水=1∶4）和KMnO4溶液，振荡均匀，室温下静置30 min，然后加入KI溶液，用Na2S2O3溶液进行滴定，当溶液由深黄色变成浅黄色时，加入淀粉指示剂1 mL，继续滴定，当颜色变为无色时，记录消耗的Na2S2O3溶液体积（A），空白试验用等量水重复以上操作，记录消耗Na2S2O3溶液体积（B），计算氧化值（Ox）。Ox=（B-A）×C×200/（5×0.002×V×M）。式中，OX即馏分消耗的KMnO4体积（mL/g），C 为Na2S2O3溶液浓度（mol/L），V 为馏分取样量（mL），Na2S2O3与KMnO4反应摩尔当量比为5，KMnO4溶液浓度0.002 mol/L，样品体积为200 mL，M为取样量。

2.3.5 样品测定

取丹参及酒、醋、盐丹参样品，测定吸水膨胀度、pH值、相对密度及氧化值，结果见表1。

表1 丹参及酒、醋、盐丹参物性指标测定结果

2.4 主客观方法相结合确定各指标权重

2.4.1 层次分析法

AHP是一种定性和定量相结合、系统化和层次化的分析方法，根据丹参中各指标成分的含量及药理活性，将指标成分含量作为权重予以量化，确定各指标的优先顺序为丹参酮ⅡA>隐丹参酮>总黄酮，构建各指标成对比较的判断优先矩阵，判断矩阵评分情况见表2。

表2 各评价指标成对比较的优先判断矩阵及权重系数

①计算判断矩阵的最大特征根（λmax）：λmax=。式中，λmax为判断矩阵的最大特征根，X为经过归一化后的判断矩阵，ωi为第i项指标的权重系数，n为样本量。②对判断矩阵进行一致性检验：CI=，CR=CI/RI。CI为一致性指标，RI为随机一致性0.52，CR表示对判断矩阵进行一致性检验。③通过对矩阵进行归一化处理计算出权重系数，分别为0.500 0、0.333 3、0.166 7，一致性比率因子CR为0，一致性检验通过，即指标优化比较矩阵通过一致性检验，表明各评价指标权重系数有效。

2.4.2 CRITIC法

丹参中总黄酮、丹参酮ⅡA、隐丹参酮含量为指标含量越高越好。对于第i个个体，第j个指标越高越好，适用于公式：dij=。式中，dij表示数据的标准化，fij表示第i个个体的第j项指标。

用无量纲化处理的标准数据进行标准差分析计算对比强度：Si=。式中，zij为无量纲处理后的样本指标值，为第i个指标的样本均值，m为指标个数，n为样本个数。经计算S总黄酮=0.425，S丹参酮IIA=5.565，S隐丹参酮=8.030。

用处理后的标准化数据计算冲突性：Cj=，Wj=。式中δi为标准化之后各列指标的标准差，Cj表示第j评价指标所包含的信息量，Wj表示第j个指标的客观权重。

经计算得出总黄酮、丹参酮IIA、隐丹参酮的权重系数（ωi）为0.020 5、0.497 8、0.481 7。

2.4.3 AHP-CRITIC法综合权重的确定

AHP侧重于决策者的主观爱好，而CRITIC法侧重于挖掘数据本身所蕴含的客观信息，因此，将主观权重与客观权重综合考虑，将2种方法相结合能更加合理地计算出综合权重（ω综合ij），经计算AHP-CRITIC法结合的综合权重为0.040 0、0.646 9、0.313 1。

2.4.4 3种权重分析方法计算的综合评分结果比较

选用上述3种权重系数分别对试验数据进行综合评分。采用SPSS25.0统计软件对3种评分结果进行相关系数分析，AHP 与AHP-CRITIC 法评分相关系数为0.990，CRITIC 法与AHP-CRITIC 法评分相关系数为0.998，AHP与CRITIC法评分相关系数为0.991，三者相关性极显著（P<0.01）。AHP与CRITIC法权重系数的相关系数为0.851，相关性不显著（P=0.352），表明这2种方法所反映的信息叠加性不强，AHP-CRITIC法平衡了主观因素和客观因素的影响，所体现的信息更为合理，故选择AHP-CRITIC 法进行综合权重评分（Y）。

2.4.5 用原始数据计算综合评分

采取以下公式计算综合评分Y，公式中Y和“2.4.2”项下f值相同，均为未标准化处理前原始测量数据。当指标数值越大越好时：Y=（yi/ymax）×100ω；当指标数值越小越好时：Y=（ymin/yi）×100ω。经计算，丹参及酒、醋、盐丹参综合评分值依次为96.893 4、98.293 0、100.000 0、94.693 0。

2.5 物性指标与化学成分相关性分析

采用SPSS软件对丹参不同炮制品物性指标与化学成分进行Pearson相关性分析，结果见表3。通过分析相关性可知，丹参炮制品物性指标pH值与化学成分丹参酮ⅡA呈负相关（P<0.05）。

表3 丹参物性指标与化学成分的相关性分析（r）

2.5.1 pH值与丹参酮ⅡA含量回归分析

以pH值为因变量、丹参酮ⅡA含量为自变量，得线性回归方程Y=56.381-0.129X，R2=0.939，P<0.05。以丹参酮ⅡA含量为因变量、pH值为自变量，得线性回归方程Y=432.511-7.249X，R2=0.939，P<0.05。表明2个模型均有统计学意义，方差分析见表4、表5。

表4 pH值对丹参酮ⅡA含量回归模型方差分析

表5 丹参酮ⅡA含量对pH值回归模型方差分析

2.5.2 综合评分与pH值相关性分析

建立综合评分与pH值的多元线性回归方程：Y=113.531-2.617X，R2=0.751，P<0.05，表明该模型有统计学意义。综合评分与物性指标pH值呈显著负相关。

3 讨论

中药成分复杂，具有多成分、多靶点、多层次的作用特点，检测其中1种指标无法代表中药的整体疗效，因此，采用多指标综合评价有利于控制中药饮片的质量，对于丹参的内在质量评价指标选取应多元化与综合化，化学成分研究也应注重整体性[15]。丹参具有广阔的市场前景和发展潜力，但目前对丹参的临床应用主要集中在治疗心脑血管疾病方面，以活血功效为主[16]。有研究表明，总黄酮具有抑菌、抗炎、活血化瘀作用，能够促进伤口的愈合；丹参酮ⅡA具有治疗心血管疾病、改善冠状动脉血循环、抗动脉粥样硬化等作用[2]；隐丹参酮具有抗氧化、抗衰老作用，对治疗冠心病、心绞痛、心肌损害有一定的疗效[5]。本试验选取2020年版《中华人民共和国药典》规定的其中2个化学成分及具有显著活性的总黄酮，探讨其与物性指标之间的相关性，为完善丹参多层次的质量标准提供依据。

中药的化学组成和物性指标共同影响着中药质量，为提升中药饮片的质量控制，需要综合研究物理属性与化学属性，以及2类指标之间的相关性[16]。目前，我国中药饮片的质量评价标准主要由外观性状和内在质量等因素综合确定。即从形、色、气、味、质等方面来鉴别分析药材的真伪优劣，虽简便易行，但易受到人的感官因素及检测环境等影响，客观性和一致性难以保证[12]。中药质地可由淀粉、多糖类物料经加热炮制后，影响其比例，进而表现为饮片质地变化，即相对密度发生改变；pH 值的变化以指示饮片酸碱变化[12]；饮片形状大小和粒径的变化会导致吸水率发生改变[17]；氧化值的变化能表征中药酸败度及气味变化[12]，对于中药炮制学科而言意义重大。炮制过程是物理性质和化学性质发生变化的过程，经炮制后，炙法炮制过程对中药成分影响较大的Maillard反应能引起连锁性氧化还原反应并使其具有焦香气味[18]，伴随着pH值及氧化值等物性指标的变化，以相对密度、吸水膨胀度、氧化值、pH值对饮片及炮制前后的传统经验术语评价量化，探索物性指标与化学成分性质之间的相关性，可为中药质量控制提供更全面指导[7，19-21]。

在多指标综合评价中，确定各评价指标的权重系数是首先需要考虑的问题。实验采用主观赋权的AHP与客观赋权的CRITIC法相结合，对各评价指标进行综合权重分析，既能避免AHP 的主观意识，也能避免CRITIC法对指标间关系的忽视[21]，将主客观2种方法结合，能够体现数据信息的科学性，可保证数据点均匀分散、结果客观、稳定，并全面、客观地反映实验结果的真实性和准确性，为中药质量评价标准提供参考[22]。

近年来课题组提出中药物性指标概念，将中药本身固有属性作为基点，把物性指标-化学成分作为一个评价中药质量的整体，其中物性指标可用相对密度、pH值、氧化值及吸水率等参数表征，适用于中药质量控制与评价[23]。经前期文献研究，本试验从化学成分和物性指标进行综合考察，以丹参酒醋盐炙法炮制品为研究对象，采用化学成分总黄酮、丹参酮ⅡA和隐丹参酮与物性指标吸水膨胀度、相对密度、pH值、氧化值的客观指标综合性评价酒醋盐炙法炮制对丹参饮片影响，对中药物性指标及成分进行含量测定，运用AHP-CRITIC 法结合SPSS 软件对数据进行统计分析，经相关性分析，丹参pH 值与丹参酮ⅡA呈显著负相关关系，在一定程度上可建立pH值与丹参酮ⅡA的数学模型，用以指征丹参酮ⅡA的含量高低。建立丹参物性指标-化学成分之间的相关性联系，诠释饮片炙法炮制的动态变化过程，探究酒醋盐炙法炮制对丹参饮片影响，为实现饮片的临床开发应用及炙法炮制工艺的智能化、标准化、数字化研究提供参考。本研究模型的准确性尚需后期扩大样品量进一步研究。