血浆miR-138水平与冠心病的关系及对HepG2细胞Sirt1基因的影响

李斯 尹明洁 米颖　孙雅楠

【摘要】  目的  探讨血浆miR-138水平与冠心病（coronary heart disease，CHD）的关系及对HepG2细胞沉默信息调节因子（sirtuin type 1，Sirt1）基因mRNA表达的影响，评价血浆miR-138应用于CHD临床诊断的价值。方法  选取2018年1月- 2020年1月在医院诊断CHD并完成冠状动脉造影的患者30例为病例组（CHD组）及健康人员28例为对照组。检测两组血浆miR-138的水平及HepG2细胞Sirt1基因mRNA表达水平；通过单因素分析及多因素Logistic回归分析血浆miR-138的水平与CHD的关系，并通过ROC曲线评估血浆miR-138的水平对CHD的诊断价值。结果  单因素分析显示，CHD组血浆miR-138的水平显著低于对照组，差异有统计学意义（P<0.01）；多因素Logistic回归分析显示，血浆miR-138的水平降低，发生CHD的危险性增加（P<0.05）。ROC曲线下面积AUC=0.768（95%CI：0.626～0.909），临界值=0.00162，此时血浆miR-138诊断CHD的灵敏度=73.333%，特异度=100.000%，Kappa=0.726，具有临床应用价值。miR-138转染组Sirt1 mRNA水平显著低于对照组，组间差异有统计学意义（P<0.005）。结论  血浆中miR-138的表达水平与CHD有关联，血浆中miR-138的表达水平降低，CHD的风险增大，在对CHD的诊断中有一定价值。转染miR-138能够抑制HepG2细胞mRNA表达。

【关键词】   miR-138；冠心病；HepG2细胞；Sirt1

中图分类号  R541.4    文献标识码  A    文章编号  1671-0223（2023）05--04

随着时代的发展，人们生产生活方式的改变，冠心病（coronary heart disease，CHD）的患病率逐年升高，已经成为威胁人类健康的主要致病因素之一。miR-138是microRNA组成之一，目前报道显示，其能够参与血管内皮细胞增生、分化，以及调控细胞的凋亡[1]，表明其在CHD的形成过程中可能存在一定在作用。沉默信息调节因子（sirtuin type 1，Sirt1）是一种组蛋白脱乙酰酶，主要依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸发挥作用，Sirt1 能够广泛的存在于机体组织当中，并且参与到机体能量代谢的调整以及细胞周期的调整，延缓细胞凋亡，延缓细胞衰老 [2]。血浆miR-138水平与CHD的关系尚未见报道，并且miR-138是否对HepG2细胞Sirt1基因产生影响仍不明确。本研究检验CHD患者血浆中miR-138表达变化情况，在HepG2細胞中研究miR-138对Sirt1基因的影响，评价血浆miR-138用于CHD临床诊断的价值。

1  对象与方法

1.1  研究对象

选取2018年1月- 2020年1月在医院诊断CHD并完成冠状动脉造影的患者30例为病例组（CHD组）。根据年龄及性别等基本资料与CHD组相匹配的原则，同时选择健康人员28例为对照组。本研究由医院伦理委员会批准通过，并向所有研究对象进行宣讲知情同意，所有研究对象表示同意参与并签署知情同意。

（1）CHD的诊断及入组标准：依据2011年《USA心脏学会以及UA/非ST段抬高心肌梗死指南》，冠心病患者具备以下特点之一：①患者在既往的病史中已存在心绞痛的症状，近期（1个月）内，心绞痛症状较前加重或心绞痛症状发作频率增加；②患者的心绞痛症状，为近1个月之内新发生的症状；③患者如为静息性心绞痛的发作满足：患者在休息或者安静时（非劳累状态下）发作的心绞痛症状；④患者近期（1个月）内心绞痛的症状发作的持续时间延长，并经给予含服硝酸酸甘油后效果比较差的。其次对于临床诊断CHD的患者，需要经冠状动脉造影检查，如至少1支冠状动脉血管的直径狭窄程度≥50%。

（2）排除标准：①患有存在先天性心脏病或者存在心脏瓣膜病的，已临床明确诊断的具有严重的充血性心衰患者；②患者近3个月内，出现的造成损伤性血管的疾病，近1个月出现急性炎症感染的疾病等；③患者目前存在肝脏、肾脏及其他脏器的重症疾病及风湿免疫类或肿瘤类疾病，严重的颅内血管病、外周动脉栓塞及闭塞等。

1.2  实验室检验

1.2.1  血浆miR-138表达水平检测

（1）标本采集：空腹8h后，于次日清晨早8h（CHD患者在行冠状动脉造影之前），行静脉采血，分离血浆，收集标本。

（2）血浆中总RNA的提取：此部分实验是应用mirVana Paris Kit试剂盒完成本部分实验，实验根据说明书操作，按步骤来提取血浆RNA，将提取总RNA试管放置于-80℃的冰箱内进行冻存保留。

（3）cDNA的合成：应用实时荧光定量PCR技术以Taqman探针法进行，配置RT-PCR反应体系：加入10×缓冲液0.8μl、加入RNA 4.5μl、加入dNTP 0.2μl、加入抑制剂为 0.1μl、加入无水的RNase 0.4μl、加入RNA引物1.5μl、加入RTase 0.5μl，总体系为8μl，经充分混匀后离心，反应体系配置过程均在冰板上进行。反应条件设置为：16℃ 60min、42℃ 60min、85℃ 5min、4℃forever。

（4）qRT-PCR：体系配置：吸取所需物质配置反应体系，加入2× TaqMAN universal PCR Master混合物为10μl、加入无水RNase 5μl、加入TaqMAN 探针1μl、加入cDNA为 4μl，反应体系总量为20μl，摇匀后离心。反应条件为：模板预变性时间为95℃经10 min，中模板变性时间95℃经15s、60℃经60s后进行退火，共40循环；本部分试验样本均做副管，实验重复做3次，仔细记录每一次实验的CT值结果，经计算取平均值录入数据，后期经2-∆CT转换，进行统计。

1.2.2  HepG2细胞Sirt1mRNA水平检测

（1）HepG2细胞经传代培养后进行转染实验：将HepG2细胞用PBS洗2次，将配制好的miR-138转染复合物，分别加入到6孔板中，加入Opti-MEM培养基750μl/孔，混合均匀，于 37℃、5.0﹪CO2、饱和湿度条件的培养箱中培养24h。

（2）细胞qRT-PCR：①细胞总RNA的提取：转染实验结束后轻柔剥离细胞，使细胞脱落并进一步应用裂解液裂解，吸取上清液，加入等体积的异丙醇加入离心管，留取试管底部会白色沉淀物，吸取75%的乙醇1ml缓慢沿管壁加入离心管，离心后弃去。于室温下干燥5min，使乙醇完全挥发，加入70～80μl 焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水溶解沉淀，待miRNA沉淀完全溶解后，-80℃冰箱保存。②细胞mRNA qRT-PCR：

引物序列Sirt1：5' CTACTGGTCTTACT TTGAGGG3'（上游）；

5'CAAGGGATGGTATTTATGCT3'（下游）

β-actin：5'ACAGAGCCTCGCCTTTGC3'（上游）

5'CCACCATCACGCCCTGG3'（下游）

以β-actin作为内参，配置每个反应体系：2×One Step SYBR®RT-PCR Buffer 4 10μl、PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2 1.0μl、PCR Forward Primer（10μM）1.0μl、PCR Reverse Primer（10μM） 1.0μl、总RNA4.0μl、RNase Free H2O 3μl，总反应体系共20μl。反转录条件：42℃30min、95℃10min 1個循环，PCR反应条件：95℃10s、60℃60s 40循环。实验结束后记录反应的Ct值，进行实验统计。

1.3  数据处理方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析。计数资料计算百分率（%），率的比较采用卡方检验；正态分布的计量资料使用“±s”表示，采用独立样本检验；非正态分布的计量资料用“M（P25，P75）”来表示，组间中位数比较采用Kruskal-Wallis秩和检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2  结果

2.1  两组人员临床特征比较

CHD组BMI水平、吸烟比例显著高于对照组，差异有统计学意义（P<0.001）；两组性别、年龄、空腹血糖（FPG）、血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

2.2  血浆miR138表达水平与冠心病的关系

2.2.1  单因素分析  CHD组与对照组血浆miR138表达水平比较结果显示，CHD组血浆miR-138的表达水平显著低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），表明血浆miR-138的表达水平与冠心病有关联，见表2。

2.2.2  多因素分析  以是否冠心病患者为因变量（是=1，否=0），以表1中有统计意义的因素及血浆miR-138表达水平为自变量，进行多因素Logistic回归分析，结果显示，在控制了其他因素影响后，血浆miR-138表达水平仍然与冠心病有关系（P<0.05），血浆miR-138表达水平降低，冠心病发病风险增加，见表3。

2.3  血浆miR-138水平对CHD诊断价值

ROC曲线结果显示，AUC=0.768（95%CI：0.626～0.909），说明血浆miR-124水平对于CHD具有一定的区分度，根据约登指数筛选的诊断临界值为0.00162，见图1。以血浆miR-138表达水平<0.00162为诊断CHD的标准，诊断结果见表4。结果显示，血浆miR-138诊断CHD灵敏度73.333%，特异度100.000%，具有较高的真实性，并且Kappa值为0.726，诊断结果与实际结果高度一致，具有临床应用价值，见表4。

3  讨论

CHD是威胁人类健康的首要治病因素，是心肌梗死、心源性猝死的前期病症，但是CHD的诊断仍依据患者的临床症状，心电图甚至是冠状动脉造影检查术，目前仍缺乏对于CHD精准诊断的简便方法。miRNA是一类非编码的小RNA分子，它在多种生物学功能发挥调节作用，对靶基因表达方面发挥抑制mRNA翻译或促进mRNA降解的负性调节因子[3]。miRNA在人体生理以及病理过程中发挥一定作用，其中miR-138报道与心血管内皮细胞迁移、增殖及细胞周期代谢相关[2]，但是miR-138表达水平是否在CHD患者发生变化目前尚未见报道。

关于miR-138的功能研究显示，高表达miR-138能够显著抑制血管内皮祖细胞的迁移及血管生成作用，应用白藜芦醇后能够显著抑制miR-138的表达水平，并且改变其对内皮祖细胞的作用，改变血管生成及迁移，改变血栓的机化再通作用[4]。还有研究提示GECs细胞中miR-138处于中低表达水平，过量表达miR-138能够抑制胶质瘤的血管新生过程，研究中还证实miR-138能够负性调控SOX13因子的表达发挥抑制胶质瘤血管的新生，抑制肿瘤的迁移及转移，在控制肿瘤转移中发挥重要作用[5]。还有学者研究表明，miR-138的上调通过下调Lcn2的促凋亡基因表达来抑制缺氧诱导的心肌细胞凋亡[6]。基于miR-138在心血管细胞调节中的作用，此次研究显示在CHD患者血浆中miR-138水平显著低于正常对照组，在CHD发病过程中与miR-138过渡消耗可能相关。

目前有报道显示miR-138具有参与细胞凋亡及调整细胞周期的作用。学者建立了人脐静脉内皮细胞的衰老模型，因为人脐静脉内皮细胞的增殖能力会伴随培养时间的延长而逐渐下降。在实验中，研究者发现miR-138能够稳定表达，表达水平与培养时间正相关，并且通过细胞凋亡及增殖实验发现其具有促进凋亡作用[7]，发现miR-138能够通过缩短细胞周期，发挥通过促进细胞衰老的作用抑制内皮细胞的增殖[8]。在细胞凋亡过程中，Sirt1起到重要作用，具有维持基因组的稳定性，延长细胞寿命，以及在调整细胞周期中起到重要作用[9]，其机制可能通过内皮型一氧化氮合酶等因子的靶基因作用，延缓细胞衰老等、促进细胞功能的作用[10]。研究显示miR-138可能对Sirt1基因表达产生影响，如大鼠缺氧心肌细胞中证实，Sirt1的转染可以产生对缺氧心肌细胞的保护作用，miR-138能够抑制Sirt1基因的表达，调节缺氧心肌细胞的凋亡，而miR-138抑制剂转染后能够减少缺血缺氧心肌细胞的凋亡[11]。然而在miR-138是否对Sirt1因子mRNA水平发挥调节作用，是否对Sirt的蛋白转录过程起关键作用，目前未见报道。本次研究显示，转染miR-138能够显著抑制HepG2细胞mRNA表达，但在转录后翻译过程中是否发挥作用需进一步研究证实。

综合以上，CHD患者血浆中miR-138表达水平降低，可能是由于其在CHD发生发展中存在过度消耗，miR-138能够抑制HepG2细胞Sirt1基因mRNA的表达，但其是否对Sirt1蛋白表达产生影响，有待于之后的研究进一步证实。

4  参考文献

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[2023-01-09收稿]