牦牛肺脏各支气管中EPO的表达差异研究

杨映雪，贲祖丽，许 瑾，梁 娜，吴绍米，杨 琨,2,3*

（1.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030；2.甘肃省动物细胞技术创新中心，甘肃 兰州 730030；3.西北民族大学生物医学研究中心，甘肃 兰州 730030）

青藏高原位于中国西部，平均海拔4 000 m以上，是世界上海拔最高的高原。由于海拔高，其气候干燥、空气稀薄，且紫外线辐射强；气温低，年平均温度在0 ℃以下，大片地区最暖月平均温度不足10 ℃；降雨量少，但雪层深厚，冰川融水量大，因此也是东亚、东南亚和南亚许多大江大河的发源地。青藏高原特殊的地理环境造就了其高寒、低氧、强辐射等气候特征[1]。

牦牛主要分布于我国西部地区3 600 m以上的高原，能适应高原低温缺氧、变化无常的极端天气，被当地农牧民作为主要经济收入来源而饲养，作为青藏高原特有的经济畜种，对当地产业发展具有重要意义[2]。高原牦牛对疾病具有强耐受性和抵抗力[3]，同时由于长期的自然选择、优胜劣汰，其对低氧环境有良好的适应性[4]。现有牦牛品种在生理、生化和形态学上具有稳定的遗传学特征[5]，是研究高原动物低氧适应性的理想材料。肺脏直接与外界相通，是动物体呼吸系统里最重要的器官，机体对氧气的吸收通过肺脏进行，其在动物适应高原缺氧环境方面起着十分重要的作用[6]。

促红细胞生成素（EPO）是一种激素，由肾皮质肾小管周围间质细胞和肝脏分泌产生，对刺激红细胞生成具有重要作用[7]。除造血功能之外，EPO在低氧刺激下还表现出多种组织保护作用[8]。目前对牦牛肺脏或EPO的相关研究虽然较多，但对二者间关系的研究较少。本研究通过H&E染色、免疫组织化学染色的方法，探讨EPO在牦牛肺脏各级支气管的分布与表达情况，为EPO在牦牛肺脏低氧适应性方面提供基本的数据支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料与处理

1.1.1 试验材料 试验材料取自青藏高原天然牧场的健康成年牦牛。将牦牛屠宰后，取肺脏组织样，并立即用4%多聚甲醛进行固定保存。

1.1.2 材料处理 根据肺脏组织结构，将需要的组织样切为1 cm3大小的方块，用组织石蜡包埋法包埋，将其切至5 μm厚的组织切片，再进行H&E染色与免疫组织化学染色。

1.2 试验试剂

抗兔SP试剂盒（SP-0023）与多克隆抗体EPO（bs-2343R）均购于北京博奥森生物技术有限公司；DAB染色试剂盒（C02-04001）购自北京索莱宝科技有限公司。其他试剂包括：PBS（磷酸盐缓冲液），0.01 mol/L柠檬酸钠缓冲盐，伊红，苏木精，二甲苯，各浓度乙醇。

1.3 试验方法

1.3.1 H&E染色 将样本按照脱水、透明、浸蜡、包埋的步骤进行处理，并将其制成5 μm厚的组织切片，将切片按照烤片、脱蜡、苏木精核染、酸水分化、自来水返蓝、伊红染色、酒精分化、脱水、透明、封片的步骤进行H&E染色，观察其组织结构是否正常。

1.3.2 免疫组织化学染色 将组织切片置于烤片机上，45 ℃脱蜡15 min后，用柠檬酸钠缓冲液进行抗原修复；切片冷却至室温后，用多克隆抗体（阴性对照则将一抗稀释液换为PBS）在37 ℃下孵育2～3 h，再加入二抗（SP试剂盒B液）进行反应；用PBS缓冲液冲洗后，滴加DAB显色液，显色5～10 min后观察染色程度；苏木精复染2 min后，进行酸水分化和自来水冲洗返蓝，并将组织切片脱水、透明、封片后进行镜检。

1.3.3 图像采集与结果判定 把经过H&E染色与免疫组化染色的切片用3% H2O2溶液阻断内源性过氧化物酶，并用封闭液（SP试剂盒A液）进行封闭；在组织切片上滴加1∶300比例稀释的EPO，反应后置于显微镜照相系统下进行图像采集，并观察分析。免疫组化染色结果有强阳性表达、弱阳性表达和阴性表达3种，3种结果对应的显色效果分别是深棕色、黄棕色、未出现棕黄色或与背景色相似。

2 结果

2.1 H&E染色结果

如图1所示，经H&E染色后发现该牦牛肺脏各级支气管结构正常，未发现病变。肺内小支气管管腔较大，有明显皱襞，不连续平滑肌束位于固有层下；细支气管管腔变小，皱襞发达且排列紧密；终末细支气管皱襞逐渐消失，平滑肌变为薄薄一层；呼吸性细支气管管壁不完整，管壁由单层纤毛柱状上皮过渡为单层柱状或立方上皮。

图1 肺脏H&E染色结果

2.2 免疫组织化学染色结果

如图2所示，牦牛肺脏小支气管、细支气管、终末细支气管和呼吸性细支气管上均有EPO表达，且黏膜皱襞或黏膜上皮细胞为强阳性表达，呈深棕色；平滑肌层、黏膜下层和外膜为弱阳性表达，呈黄棕色；透明软骨多为阴性表达，与背景颜色相近。总体表达情况呈现出黏膜上皮细胞强于平滑肌细胞、黏膜下层细胞与外膜细胞的现象。

图2 不同倍镜下的免疫组化染色结果

2.3 EPO免疫组化阴性对照染色结果

如图3所示，牦牛肺脏各级支气管均为阴性表达，排除免疫组化染色结果为假阳性与假阴性的可能。

图3 不同倍镜下牦牛肺脏阴性对照结果

3 讨论

与平原动物不同，高原动物出生便处于低氧环境下，习服不良，这使红细胞增多症为代表的高原病高发，牦牛作为高海拔低氧环境中的特有牛种，不仅在高原中较其他动物生存历史长，而且对低氧环境适应良好。肺脏作为主要呼吸器官，与外界低氧环境相通，在低氧适应性上具有不可忽视的作用[8]。

低氧条件下，EPO发挥着重要调节作用。有研究表明，缺氧诱导因子-1α（hypoxiainducible factor-1α，HIF-1α）参与氧平衡过程，是低氧条件下重要的调控因子[9]。HIF-1α具有许多下游调控因子，EPO就是其中之一。此外，在体外缺氧缺血模型中，HIF-1α基因的表达被EPO以剂量依赖的方式抑制[10]。除HIF-1α外，HIF-2α也可以通过EPO对血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）进行调节，从而刺激血管生成[11]。由此可见，EPO在低氧相关调控通路中具有重要作用。同时，Samson等[12]的研究证实了EPO可通过抑制caspase保护细胞免受缺氧诱导的凋亡，具有一定的组织保护作用；且肺内皮细胞EPO-R/Akt信号通路可能介导了EPO的保护作用[13]。

EPO具有抑制红系祖细胞凋亡、促进原红细胞存活的作用，是红细胞生成调控过程中的关键因子[8]。而肺脏中运输氧气和二氧化碳的红细胞是关键细胞，在呼吸过程中有重要作用，红细胞数量的多少在一定程度上决定着呼吸强度。相关研究表明，当机体处于缺氧或低氧时，机体中EPO的含量会升高，结合本试验结果中EPO的表达推断出牦牛肺脏中EPO的分泌随着海拔的升高而增多，从而刺激红细胞生成，使牦牛能够在低氧环境下更好地生存，对牦牛低氧适应性具有重要作用。

4 结论

牦牛肺脏各级支气管中EPO的表达情况呈现出黏膜上皮细胞强于平滑肌细胞、黏膜下层细胞与外膜细胞的现象。EPO在各级支气管中的表达表明其对牦牛肺脏低氧适应性具有重要调控作用。