基于特异性引物高效构建TALE 文库

蔡思杰， 张书衍， 王晓微， 郭显阳， 詹 硕

(1. 沈阳大学 生命科学与工程学院， 辽宁 沈阳 110044;2. 沈阳双鼎制药有限公司， 辽宁 沈阳 110179)

1 前 言

转录激活因子样效应物(TALE)是黄单胞菌分泌的针对特定DNA 序列的蛋白质[1-2]。TALE 家族成员包含一个高度保守和重复的区域，其与DNA 的结合能力取决于每个模块重复的第12 和第13 个氨基酸残基(即重复可变双氨基酸残基(RVD))。每个RVD 中都有一个简单的代码，用来指定对特定碱基的识别，这决定了TALE 核苷酸结合的特异性。例如，NI(Asn/Ile)对应A，NG(Asn/Gly)对应T，HD(His/Asp)对应C，NH(Asn/His)对应G[3-5]。人工构建的带有功能域的DNA 结合域(DBD)补充的TALE 可应用于基因工程的许多方面，包括用于转录调控的转录因子(TALE-TF)[6-9]和用于基因组编辑的转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)[10-12]。因此，TALE 在基因工程领域发挥了巨大的作用。

TALE 的脱靶率比目前热门的 CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9)[13-15]要低，识别DNA 长度也较长；基因调控和编辑的位置不受前间区序列邻近基序(PAM)的限制；具有更低的非靶点结合能力，更低的细胞毒性，基于TALE 具有高靶向能力[16]，所以，已由法国Cellectis 公司用于生产通用嵌合抗原受体T 细胞[17]，并已被批准用于癌症免疫疗法。接受该基因编辑疗法的患者已显示出显著的治疗效果[18]。最重要的是，在设计和构建TALE 时，理论上可以靶向任何DNA序列。但是构建TALE 的方法比较繁琐复杂，而且构建的TALE 长度有限，容易脱靶。并且，大多数研究人员仍然使用软件来预测TALE 靶向的目标区域，然后构建一个有针对性的TALE。在这种情况下，需要构建更多的TALE，构建周期太长，效率偏低[19-21]。

本研究发明了一种新的简单的TALE 文库的构建方法，设计了一种可以轻松实现靶向较长DNA 序列的TALE 文库的方法。该组装方法是快速且标准化的，能够精确控制产生的RVD 和整体DNA 结合域的组成。而且研究人员可以直接将其作为实验材料，为TALE 研究人员节省了大量的时间。

2 材料与方法

2.1 材料

金门组装试剂盒来自Addgene；限制酶BsaI、牛血清白蛋白(BSA)、T4 DNA 连接酶、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)来自NEB 公司；质粒核酸安全酶来自Epicentre 公司；BsmBI 来自Thermo Scientific 公司；DH5α感受态细胞、壮观霉素、卡那霉素、X-gal、IPTG(Isopropyl β-D-Thiogalactoside，异丙基硫代半乳糖苷)来自南京源恩浩生物试剂；PrimeSTAR®GXL DNA Polymerase 高保真聚合酶混合液来自Takara 公司。

2.2 方法

采用基于金门组装试剂盒优化改进的新方法构建了18 bp-TALE-VP64 文库(bp 表示碱基对)。

第1 部分：构建含10 个串联重复序列(RVDs：NH1-NH10)组合的PFUS-A+10×NH 质粒。

步骤1(第1 天，3 h)：第1 次金门酶切连接反应。将10 个RVD 构建模块质粒(NH1 到NH10)各加入150 ng 于0.5 mL 离心管中。然后，加入150 ng pFUS-A 质粒、1 µL BsaI、1 µL BSA、1 µL T4 DNA 连接酶、2 µL T4 DNA 连接酶反应缓冲液。然后加入蒸馏水，使总反应体积达到10 µL。

步骤2(第1 天，10 min)：上述反应体系混合并短暂旋转，涡旋混匀30 s。

步骤3(第1 天，3 h)：将反应体系在PCR 仪上孵育。孵育条件为37 ℃、5 min 和16 ℃、10 min 共计10 个循环，然后50 ℃、5 min；80 ℃、5 min。

步骤4(第1 天，1 h)：反应体系(10 µL)加入1 µL 质粒核酸安全酶和1 µL 10 mmol·L-1ATP 在37 ℃下孵育1 h。

步骤5(第1 天，4 h)：将步骤4 的反应体系转化到100 µL DH5α 中，加入溶菌肉汤(LB)液体培养基得到1 mL 该细胞悬液，涂布于LB 琼脂细菌培养皿(含有壮观霉素50 μg·mL-1和20 mg·mL-1X-gal) (X-gal是β-半乳糖苷酶的显色底物)以及0.1 mol·L-1IPTG，由于PFUS-A+10×NH，PFUS-B7+7×NH 和pLR-NH骨架质粒都具有壮观霉素抗性，所以，培养微生物大肠杆菌细胞DH5α，有抗性的说明质粒构建转染成功，没有转染成功的没有抗性，不会生长出菌落。

步骤6(第2 天，6 h)：从培养皿上挑选几个白色菌落，并使用引物pCR8-F1 和pCR8-R1(表1)进行菌落PCR 检验。PCR 程序：96 ℃预变性3 min；96 ℃变性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸2 min，进行30 个循环；72 ℃总延伸3 min，4 ℃保存。PCR 检测正确的菌落经过培养、提取，得到PFUS-A+10×NH质粒。

表1 质粒突变体和菌落PCR的引物Table 1 Primers for plasmid mutation and colony PCR

第2 部分：构建含有7 个串联重复序列(RVDs：NH1-NH7)组合的PFUS-B7+7×NH质粒。

步骤1(第1 天，3 h)：取7 个RVD 构建质粒模块(NH1 到NH7)各加入150 ng，加入pFUS-B7 质粒150 ng、1 µL BsaI、1 µL BSA、1 µL T4 DNA 连接酶、2 µL T4 DNA 连接酶反应缓冲液。然后加入蒸馏水，使总反应体积达到10 µL。

步骤2(第1 天，10 min)：反应体系短暂旋转混合，涡旋混匀30 s。

步骤3(第1 天，3 h)：将反应体系在PCR 仪上孵育，孵育条件为37 ℃、5 min 和16 ℃、10 min 共计10 个循环；然后50 ℃、5 min；80 ℃、5 min。

步骤4(第1 天，1 h)：反应体系(10 µL)加入1 µL 质粒核酸安全酶和1 µL 10 mmol·L-1ATP 在37 ℃下孵育1 h。

步骤5(第1 天，4 h)：将步骤4 的反应体系转化到100 µL DH5α 感受态细胞。然后加入LB 培养基得到1 mL 细胞悬液涂布于LB 琼脂细菌培养皿(含有壮观霉素50 µg·mL-1和20 mg·mL-1X-gal 以及0.1 mol·L-1IPTG)。

步骤6(第2 天，6 h)：从培养皿中挑选几个白色菌落，使用引物pCR8-F1 和pCR8-R1(见表1)进行菌落PCR 检测。PCR 程序：96 ℃预变性3 min；96 ℃变性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸1 min，进行30个循环；72 ℃总延伸3 min，4 ℃保存。PCR 检测正确的菌落经过培养、提取，得到PFUS-B7+7×NH 质粒。

第3 部分：PFUS-A+10×NH 质粒突变体、PFUS-B7+7×NH 质粒突变体及pLR-NH 质粒突变体的构建。

步骤1(第3 天，3 h)：PFUS-A+10×NH 质粒突变体、PFUS-B7+7×NH 质粒突变体、pLR-NH 质粒突变体均采用PCR 扩增得到，引物如表1 所示。利用HD-C、NH-G、NG-T 和NI-A 这4 种特殊引物(表1)对PFUS-A+10×NH 质粒、PFUS-B7+7×NH 质粒、pLR-NH 质粒分别进行PCR 扩增。3 个PCR反应(240 μL)均包含1 ng 质粒、10 μmol·L-1HD-C、10 μmol·L-1NH-G、10 μmol·L-1NG-T、10 μmol·L-1NI-A 和PrimeSTAR®GXL DNA Polymerase 高保真聚合酶混合液。PCR 程序：96 ℃预变性3 min；96 ℃变性20 s，58 ℃退火20 s，72 ℃ 延伸3 min，进行28 个循环；72 ℃总延伸3 min，4 ℃保存。PCR 产物用1% 琼脂糖凝胶电泳检测。PCR 产物经苯酚/氯仿萃取法纯化，用无水乙醇沉淀。PCR产物在水中重悬，3 种PCR 产物即PFUS-A+10×NH 质粒突变体、PFUS-B7+7×NH 质粒突变体、pLR-NH质粒突变体。

第4 部分：构建TALE-VP64 文库(RVDs：NH1-NH17 和pLR-NH)。

步骤1(第3 天，3 h)：在20 µL 反应体系中，包括150 ng PFUS-A+10×NH 质粒突变体，150 ng PFUS-B7+7×NH 质粒突变体，150 ng pLR-NH 质粒突变体和75 ng TALE-backbone-VP64。加入1 µL BsmBI，1 µL T4 DNA 连接酶、2 µL T4 DNA 连接酶反应缓冲液。最后加入蒸馏水使总反应体积为20 µL。

步骤2(第3 天，10 min)：该反应体系短暂旋转混合，涡旋混匀30 s。

步骤3(第3 天，3 h)：将反应体系在热循环PCR 仪上孵育。热循环条件为37 ℃、5 min 和16 ℃、10 min，共计10 个循环；然后37 ℃、15 min；80 ℃、5 min。

步骤4(第3 天，4 h)：将20 µL 的反应体系转化到200 µL DH5α 感受态细胞中。加入LB 培养基得到1 mL细胞悬液涂布于LB 琼脂细菌培养皿(含有卡那霉素50 µg·mL-1和20 mg·mL-1X-gal 以及0.1 mol·L-1IPTG)。

步骤5(第4 天，4 h)：利用引物TAL-F 和TAL-R(表1)进行菌落PCR 实验，根据电泳条带鉴定阳性菌落。最后PCR 检测正确的菌落，过夜培养。

步骤6(第5 天，2 h)：提取培养的菌液中的质粒为18 bp-TALE-VP64 文库质粒表达载体。

3 实验结果与分析

3.1 TALE 文库构建流程的建立

经过对金门法的优化构建了TALE 文库，详细流程见图1，此流程显示了构建TALE-VP64 文库的示例，该质粒文库可以结合18 bp DNA 长度的目标靶向位点。其中PFUS-A+10×NH 是一种由10 个单体质粒和一个骨架质粒PFUS-A 在第1 次酶切连接反应中制备的质粒；PFUS-B7+7×NH 是一种由7 个单体质粒和1 个骨架质粒PFUS-B7 在第1 次酶切连接反应中制备的质粒。因此，PFUS-A +10×NH 是表达与N1-N10 核苷酸结合的氨基酸的质粒载体，PFUS-B7+7×NH 是表达与N11-N17 核苷酸结合的氨基酸的质粒载体。编码与最后一个核苷酸(N18)结合的氨基酸的序列包含在另一个单体质粒(pLR-NH)中。第2 次酶切连接反应包含 4 个质粒，包括PFUS-A+10×NH 质粒突变体(PFUS-A+10×(NH，HD，NG，NI))、PFUS-B7+7×NH 质粒突变体(PFUS-B7+7× (NH，HD，NG，NI))、pLR-NH 质粒突变体(pLR-NH/HD/NG/NI)和TALE 骨架载体(TALE-backbone-VP64)(见图2，图中bp 为碱基对)。

图1 利用金门法基于4 种特异性引物构建TALE-VP64 文库的流程Fig.1 Flowchart of the construction of TALE-VP64 libraries by the Golden-Gate method based on new specific primers pipeline

图2 质粒图谱及其组成Fig.2 Plasmids maps and their elements

另外，在构建过程中所使作的各种骨架质粒图谱(即突变前质粒)见图2 中PFUS-A+10×NH、PFUS-B7×NH、pLR-NH质粒。最后，预计构建成功的TALE-VP64 质粒文库具有转染各种细胞的能力，并可以激活下游基因的表达(见图3)，Zhang 等[21]单独构建的TALE-VP64 质料转染293T 细胞，确实激活了绿色荧光基因ZsGreen，使绿色荧光蛋白高表达。TALE-VPR 质料转染HepG2细胞和PANCl 细胞，分别使得内源基因HNF4a 和E47 基因上调， 从而证实了TALE-VP64/VPR 强大的靶向和激活功能。TALE-VP64 文库中每个DNA 结合模块由34个氨基酸组成，其中每个模块的第12 和13 位氨基酸变化较大，其他氨基酸高度保守，这2 个不保守的氨基酸被命名为重复可变残基(RVD)，RVD 氨基酸对应DNA 碱基之间的分子密码是NI 对应A、HD 对应C、NG 对应T、NH 对应G，所有的TALE 由N 末端的转移结构域(AD)组成(图3)。TALE 的末端转移结构域以及C末端的核定位信号和转录激活结构域具有高度的保守性，不同成员之间互换这些功能区域并不影响其正常发挥作用。TALE-DNA 结合域与合成的VP64 转录激活因子融合，该激活因子募集RNA 聚合酶和启动转录所需的其他因子，激活下游基因的表达(见图3)。

图3 用于基因组工程的TALE-VP64 文库Fig.3 The TALE -VP64 libraries for genome engineering

3.2 质粒和文库的菌落PCR 检测

第1 部分和第2 部分中从每个平板上选取白色菌落，使用引物pCR8-F1 和pCR8-R1 进行菌落PCR检验。条带应达到预期大小(PFUS-A+10×NH 质粒约12 kb、PFUS-B7+7×NH 载体约0.8 kb (kb 表示1 000 碱基对))，但一般不可能得到单一的条带，一般条带“阶梯”从约200 bp 开始，这是正确克隆的标志，是克隆中重复的结果[22](见图4 中1 和2 泳道)。

图4 质粒和菌落 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳结果Fig.4 Results of agarose gel electrophoresis of plasmid and colony PCR products

第 3 部分中用 4 种特异引物和长链高保真 DNA 聚合酶分别扩增 PFUS-A+10×NH 质粒、PFUS-B7+7×NH 和pLR-NH 质粒(见图4 中4、6、8 泳道)，获得各个质粒载体突变体(见图4 中3、5、7泳道)，由于质粒突变体实际是PCR 产物，并且主要是各种质粒的混合物，但是也不排除有短链的一些PCR 产物，所以，从电泳图观察，质粒突变体主要条带的分子量与对应的质粒基本一致。

第4 部分中挑取4 个白色菌落用菌落PCR 检测最终18 bp-TALE-VP64 文库。全长PCR 产物通常不太突出，大约是2 051 bp，从结果观察，主条带确实在2 051 bp 左右，但是不明显。而“阶梯效应”是成功组装的有力指标[22](见图4 中9 泳道)。

PFUS-A+10×NH、PFUS-B7+7×NH、pLR-NH 骨架质粒分别与各自的质粒突变体不同，3 种质粒突变体是各自以3 种质粒(PFUS-A+10×NH、PFUS-B7+7×NH 和pLR-NH 骨架质粒)为模板，加入4 种特异性引物经过PCR 反应后得到3 种PCR 产物，PFUS-A+10×NH 质粒突变体就是PFUS-A+10× (NH，HD，NG，NI 不同排列组合)的混合物，即410种质粒的混合物；PFUS-B7+7×NH 质粒突变体就是PFUS-B7+7× (NH，HD，NG，NI 不同排列组合)的混合物，即47种质粒的混合物；pLR-NH 质粒突变体就是pLR-NH、pLR-HD、pLR-NG、pLR-NI 的混合物，即4 种质粒的混合物。

3.3 TALE 文库质粒的基因测序

将最后提取的18bp-TALE-VP64 质粒文库送基因公司测序，最后得到的测序结果见图5，图中有6 个核苷酸的重复序列(RVDs)，显示“噪声”信号。RVD结构域预期核苷酸组成与构建的18 bp-TALE-VP64 文库一致(图5)。通过基因测序验证了该文库的所有序列是正确的，并且包含所有可能的DNA 靶点的序列组合，该TALE-VP64 质粒文库对18 个碱基(ATCG)的排列组合都有靶向性，所以就是418，共计68 719 476 736个组合。所以涵盖了可能的核苷酸DNA 靶点。因为也有很多研究者构建针对11 个碱基或者12 个碱基的TALE 文库质粒，由于靶向的碱基越多，脱靶的可能性越小，此处主要是体现该质粒文库的高靶向性。另外从测序结果观察，虽然NH 对应的序列较多，但是也存在HD、NG、NI 对应的序列，由于测序的质粒文库实际是多种质粒的混合物，里面相当于418的各种排列组合的质粒的混合物。注意观察峰图，RVD 对应有几个是双峰、三峰，所以从测序结果得出，构建的文库涵盖了预期的RVD 组成。

图5 18-bp TALE-VP64 文库的DNA 测序图谱Fig.5 DNA sequencing profiles of the 18 bp-TALE-VP64 libraries

4 讨 论

先前文献报道中的构建TALE 的方法都是构建独立个体的方法，无论用什么方法来单独构建若干TALE 质粒，都不可能形成一个巨大的文库，这些方法是低效和耗时的。在本研究中，建立了一种基于独特引物组装完整、高效的TALE 文库构建的方法，与其他技术相比[23-24]，TALE 靶向DNA 目标的长度可以控制。增加DNA 靶标的长度将获得更高的特异性，然而，构建TALE 文库的成本和时间也将大大增加；另一种增加文库靶向DNA 目标长度的方法，不增加额外的实验负担或增加复杂性，包括利用RVD特异性。例如，已知RVD-NN 可以同时靶向A 和G，因此，只有4 个模块(即NH、NI、NG 和HD)可用于组装完整的TALE 文库。所以，研究构建的这4 个模块的18 bp-TALE 文库将产生最多68 719 476 736种组合。靶向DNA 长度更大的TALE 文库的组装在实验上可能很麻烦，在某些情况下，实际上是无法实现的。另一个问题在于，在破译给定的RVD 序列的TALE-DNA 结合方面存在一定程度的不确定性，这可能也会使全基因组分析中潜在目标序列的识别复杂化，这个问题可以通过染色质免疫共沉淀-测序技术(ChIP-seq)[25]进行进一步研究。总之，本研究成功建立了一种基于TALE 的多功能文库的组装方法，构建成功的TALE 文库可以利用酵母单杂交试验探索其功能完整性[26]。进一步说明，TALE-DBD 可以完全定制，以靶向任何核苷酸含量(如GC 含量丰富的DNA 区域)、核苷酸限制(如转录因子基序)或其他修饰[27-28]。最后，TALE 蛋白的编码序列易于分离和测序，便于快速识别其靶基因。总之，考虑到该组装方法的高度模块化的特性，控制其靶向DNA 长度大小从而调整其文库特异性的能力，以及构建的文库的多功能性和方便性，预计未来将有更广泛的应用。

5 结 论

在本研究中，使用TALE 试剂盒和独特设计的引物，建立了一种快速构建TALE 文库的新方法。利用该方法构建了可靶向18bp-DNA 序列的TALE 文库，并对其进行了DNA 测序验证，满足预期结果。为基因组调控和基因组编辑技术提供了简单高效的方法和实验工具。