新生儿高苯丙氨酸血症筛查及PAH 基因变异和缺失分析

2023-02-27 04:28马翠霞封露露马倩倩封纪珍
临床儿科杂志 2023年2期
关键词:石家庄市外显子表型

马翠霞 封露露 马倩倩 李 扬 封纪珍

1.石家庄市妇幼保健院遗传科(河北石家庄 050051);2.石家庄市第四医院体检中心(河北石家庄 050000);3.石家庄市妇幼保健院产前诊断科(河北石家庄 050051)

高苯丙氨酸血症(hyperphenylalaninemia,HPA)主要是由苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase,PAH)或其辅酶四氢生物蝶呤(tetrahydrobiopterin,BH4)缺乏引起的常染色体隐性遗传病,为最常见的一种氨基酸代谢障碍性疾病[1]。HPA 在不同地区、不同人群间发病率有很大不同,相关PAH基因的变异位点也有很大差异。本研究通过分析石家庄市新生儿HPA筛查及患儿基因检测结果,了解石家庄市新生儿HPA发病及基因变异情况,完善石家庄HPA患儿的基因突变谱,为进一步遗传咨询提供理论依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择石家庄市新生儿疾病筛查中心负责的22个区县107所医疗机构2017年3月至2021年5月出生的新生儿495 740例。纳入标准:①出生后3~20 d;②充分哺乳(6~8次以上)后采集足跟血。排除标准:①重复报告;②数据不完整;③死亡;④失访。

本研究获石家庄市妇幼保健院伦理委员会批准(No.202036),研究对象监护人签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 足跟血采集方法 75%乙醇消毒,使用一次性采血针刺于足跟内或外侧,深度<3 mm,弃去第1滴血后取样,用与试剂盒质控血片一致的903号血片接触血滴,使其自然渗透,采集3 个直径>8 mm的血斑,自然晾干,置4~8 ℃保存,每周定期送至筛查中心,筛查中心收到样本后于5 个工作日内进行检测并出具可疑结果。

1.2.2 筛查方法及诊断标准 苯丙氨酸(Phe)测定采用免疫荧光法,试剂为芬兰Labsystems 新生儿Phe 浓度测定试剂盒,仪器为芬兰Wallac 公司半自动VICTOR2D 1420 时间分辨荧光免疫分析仪。严格按照说明书进行检测。初筛及复查血Phe 浓度>2.0 mg/dL(120 μmol/L)为阳性。筛查阳性者召回采血测定Phe 浓度仍>2.0 mg/dL,并且苯丙氨酸/酪氨酸(Phe/Tyr)>2.0 确诊为HPA;进行尿蝶呤谱分析以区分PAH 缺乏症和BH 4缺乏症。

患儿根据治疗前最高血Phe 浓度分为经典型苯丙酮尿症(classic phenylketonuria,cPKU,Phe≥1 200 μmol/L)、轻度PKU(mild phenylketonuria,mPKU,360 μmol/L ≤Phe<1 200 μmol/L)和轻度高苯丙氨酸血症(mild hyperphenylalaninemia,MHP,120 μmol/L≤Phe<360 μmol/L)。

1.2.3PAH基因检测 采用基因测序技术对患儿及其父母PAH基因进行检测。患儿及其父母静脉血用乙二胺四乙酸抗凝后严格按照说明提取DNA,并对提取物进行质检,后进行基因组文库构建。标记探针与文库DNA杂交,用磁珠结合探针以抓取目的基因,磁珠被磁力架吸附洗脱纯化,目的基因得以富集,进而进行高通量测序。所有数据进行单核苷酸序列多态性分析(single nucleotide polymorphisms,SNP),检测到的变异位点按照美国医学遗传学与基因组学学会(American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG)指南进行致病性分析。未报道的新发变异使用MutationTaster、GERP++、SIFT、PolyPhen_2、REVEL等功能预测软件进行致病性预测。对发现的致病变异在其所在片段上、下游设计引物进行扩增及Sanger测序,进一步验证测序结果,采用Sanger 法对患儿父母进行目标基因变异验证,基因测序相关工作由北京迈基诺医学检验所完成。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0 统计软件进行数据分析。计量资料符合正态分布的以均数±标准差表示,非正态分布的以中位数M(P25~P75)表示。计数资料以例数(百分比)表示,组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HPA筛查情况

符合纳入标准的新生儿487 413例。根据排除标准排除33例,最终入组487 380例。其中男252 521例、女234 859例,采血中位日龄为3.0(3.0~4.0)d,新生儿筛查Phe浓度为0.6(0.3~0.8)mg/dL。筛查出阳性患儿191例,确诊HPA 104例,均为PAH缺乏症。其中男55例、女49例,HPA发病率为1/4686。男婴(2.2/万)与女婴(2.1/万)HPA发病率差异无统计学意义(χ2=0.05,P=0.827)。104例HPA患儿中61例为MHP(58.7%),23例为mPKU(22.1%),20例为cPKU(19.2%)。见表1。

表1 487 380例新生儿HPA筛查情况及临床表型

2.2 PAH基因变异类型及特点

104 例HPA 患儿208 个等位基因中,共检测到209 个PAH基因变异位点,62 种基因变异,所有检测到的变异均来自患儿父母。在209 个PAH基因变异位点中,8 个最常见的变异占总数56.0%,即c.158G>A(39/209,18.7%)、c.728G>A(22/209,10.5%)、c.611 A>G(14/209,6.7%)、c.331 C>T(10/209,4.8%)、c.721 C>T(10/209,4.8%)、c.442-1G>A(8/209,3.8%)、c.1068C>A(7/209,3.3%)、c.1197 A>T(7/209,3.3%)。PAH基因变异位点分布不均匀,涵盖范围较广,主要在外显子7(40/209,19.1%)、外显子2(39/209,18.7%)、外显子3(23/209,11.0%)、外显子6(22/209,10.5%)、外显子11(22/209,10.5%)。104例HPA患儿中3例为杂合变异(2.9%),3例为纯合变异(2.9%),98例为复合杂合变异(94.2%)。62 种变异位点中涉及6种变异类型,包括37个错义变异、10个剪接变异、7个无义变异、2个同义变异、1个整码变异、5个杂合变异。

在MHP患儿中最常见的变异位点有c.158G>A(37/209,17.7%)、c.728 G>A(8/209,3.8%)、c.611 A>G(8/209,3.8%)、c.320 A>G(5/209,2.4%);mPKU患儿中最常见的变异位点有c.721C>T(9/209,4.3%)、c.728G>A(7/209,3.4%)、c.611A>G(4/209,1.9%);cPKU患儿中最常见的变异位点有c.728G>A(7/209,3.45%)、c.331C>T(6/209,2.9%)、c.1068 C>A(5/209,2.4%)、c.442-1 G>A(4/209,1.9%)。

2.3 PAH基因片段缺失及未报道基因变异情况

石家庄市新生儿HPA 患儿中发现5 种杂合缺失,分别位于外显子1及上游区域、内含子1、内含子3、外显子4~5、外显子6,片段缺失分析结果见图1。经HGMD文献数据库检索外显子6杂合缺失未有与PAH相关的报道。

图1 HPA 患儿PAH 基因缺失重复分析结果

基因变异位点c.630 T>G、c.61-1 G>A、c.912+5 G>T 和c.1055+241 C>A 经HGMD 文献数据库检索未有相关报道,ClinVar数据库无该位点致病性结果分析。1 例患儿同时携带c.630 T>G 与c.61-1 G>A 两个位点,临床表型为MHP,这两个位点蛋白功能预测软件预测为有害、未知,ACMG致病性分析为临床意义未明、疑似致病性变异。c.912+5 G>T 蛋白功能预测软件为未知,ACMG致病性分析为临床意义未明,该患儿临床表型为mPKU。c.1055+241C>A蛋白功能预测软件为未知,ACMG致病性分析为临床意义未明,该患儿临床表型为MHP。见图2。

图2 HPA 患儿HGMD 文献数据库未报道基因测序图

3 讨论

食物中蛋白质分解形成的Phe 在正常状态下由肝脏PAH作用转变为Tyr,如果PAH缺乏会导致血中Phe 含量升高,通过血脑屏障在脑部蓄积,进而导致神经系统损害[2]。BH 4 是Phe、Tyr 代谢过程中的辅酶,BH 4 还原酶缺乏也会导致HPA,引起神经递质多巴胺和5-羟色胺合成障碍,损害神经系统。HPA根据病因分为PAH缺乏症和BH4缺乏症,在我国85%~90%为PAH缺乏症[3]。

HPA 在不同的国家和地区发病率有很大差异,有资料显示,欧洲不同国家HPA 的发病率为1/3000~1/30000[4],在亚洲国家中泰国较低为1/327740[5]。我国HPA发病率在南、北方地区有所不同,南方地区发病率在1/81976~1/10567之间[6-7],北方地区在1/5452~1/3495 之间[8-9]。石家庄市发病率为1/4686,明显高于南方地区,与北方地区一致,符合HPA 南低北高的特点。本研究HPA患儿基因变异以错义变异为主,发生率较高的位点为c.158G>A(p.R53H)、c.728G>A(p.R243Q)与c.611 A>G(p.Y 204 C),与一些学者研究结果一致[5,10-11],青岛、陕西与本地区略有差异[12-13]。青岛c.611A>G(p.Y204C)发生频率较低,陕西c.728G>A(p.R243Q)与c.721C>T(p.R241C)发生频率最高,甘肃c.1068C>A与c.1238G>C发生频率较高。

本组携带c.158 G>A(p.R 53 H)变异位点的39 例患儿中37 例临床表型为MHP(1 例患儿携带3 个变异位点,其中2 个为c.158 G>A),1 例患儿为mPKU,1 例为cPKU。这与相关研究的结论,即c.158 G>A(p.R 53 H)变异对PAH 酶活性影响较低一致[11]。1例cPKU患儿所携带的位点为c.158G>A、c.194 T>C 和c.842+2 T>A,预测这3 个位点的复合作用对PAH酶活性的影响较大。携带c.728G>A(p.R 243 Q)变异的21 例患儿中8 例临床表型为MHP,7 例为mPKU,6 例为cPKU 患儿(1 例患儿携带2 个c.728 G>A 变异位点,为纯合变异)。相关研究显示c.728G>A(p.R243Q)变异对酶活性影响较大[14],而本研究中携带该变异的患儿临床表型与此结论略有差异。携带c.611A>G(p.Y204C)变异的14 例患儿中8 例临床表型为MHP,4 例为mPKU,2例为cPKU。有研究显示c.611A>G(p.Y204C)变异对PAH 酶活性影响不大[15],2 例cPKU 患儿携带的变异位点分别为c.611A>G和c.331C>T、c.611A>G和c.1068C>A,考虑c.331C>T与c.1068C>A这两种变异可能对PAH酶活性的影响作用较大。本研究中变异位点导致的不同临床表型与其他研究结果较为一致[6]。

中国人群PAH 缺乏症患者携带包括点变异和片段缺失的多种基因变异。石家庄市新生儿HPA患儿中变异频率最高的区域是外显子7,而河南地区为外显子6[16]。本组5种片段缺失中外显子6杂合缺失在HGMD数据库未有PAH基因相关性的报道,该患儿携带的另外1个位点为c.611A>G,临床表型为mPKU,与前期研究中变异c.611 A>G(p.Y 204 C)对PAH 酶活性影响情况一致[23]。HGMD 数据库中未报道的基因变异为c.630 T>G、c.61-1 G>A、c.912+5G>T和c.1055+241C>A,其中c.630T>G与c.61-1 G>A 存在于同一例患儿,该患儿临床表型为MHP。携带c.912+5G>T变异的患儿,另1个变异为外显子4~5 片段缺失,临床表型为mPKU;携带c.1055+241 C>A 变异的患儿,另1 个变异为c.721C>T,临床表型为MHP。

本研究显示,石家庄HPA 患儿基因变异以错义变异为主,发生率较高的位点为c.158 G>A、c.728G>A和c.611A>G,分布区域以外显子7为主。本研究明确了石家庄市HPA患儿基因变异的类型和特点,发现外显子6杂合缺失以及c.630T>G、c.61-1G>A、c.912+5G>T和c.1055+241C>A 5个变异在HGMD数据库无相关报道,丰富和完善了石家庄市HPA患儿的基因变异图谱,为患儿家庭进行遗传咨询和产前诊断提供了重要的补充资料。

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