玛咖脂溶性成分的GC-MS指纹图谱的构建及溯源*

李明， 王涛， 陈芮

(云南师范大学 化学化工学院，云南 昆明 650500)

玛咖(LepidiummeyeniiWalp.)为十字花科(Brassicaceae)独行菜属植物玛咖的干燥根茎[1]，始产于秘鲁，有“秘鲁人参”之佳誉.最早玛咖用于解决人和牲畜的不孕不育问题，同时能增强人的免疫力，消除疲劳[2].

玛咖的活性成分主要为玛咖烯、玛咖酰胺、生物碱、芥子油苷、异硫氰酸苄酯、甾醇及多酚等[3-4].这些活性成分使玛咖具有调节内分泌[5]、预防前列腺肥大[6]及抗肿瘤[7]等作用.研究表明：玛咖中特有的玛咖烯和玛咖酰胺具有改善性功能的作用[8].Uchiyam等[9]首次证实了玛咖酰胺能够提高性激素,为玛咖能够改善性欲的传统说法提供了理论支持.刘淼等[10]发现黑玛咖中的N-苄基十六酰胺和N-十八烷酰胺为玛咖抗疲劳的有效成分.周严严等[11]采用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导斑马鱼受损的神经模型，研究了玛咖总提取物对神经的作用，并采用乙酰胆碱酶和丁酰胆碱酶进行体外实验，结果表明：玛咖中对体内和体外神经皆具有保护作用的有效成分为N-苄基十六烷酰胺.Liu等[12]发现N-苄基十六烷酰胺是玛咖抗骨质疏松的有效成分.孟倩倩和杨敏等[13-14]研究表明玛咖中脂溶性成分以苯乙腈和N-苄基十六烷酰胺为主.

由于玛咖具有多种生物活性，近年来玛咖的市场需求迅速增加，云南、四川和西藏等地竞相引种玛咖[15]，但是由于环境的不同，引种玛咖的化学成分与含量差异较大，因此研究产地对玛咖成分及含量的影响显得尤为重要.

研究采用超声辅助提取法对玛咖中脂溶性成分进行提取，结合气相色谱-质谱联用法对这些成分进行鉴定.通过对所获得的数据进行比对分析，构建了玛咖的指纹图谱.在此基础上，结合相似度评价(夹角余弦法)及化学模式识别(主成分分析，PCA)对玛咖脂溶性成分进行综合评价以期为玛咖快速溯源提供参考.

1 仪器与材料

1.1 仪器

SY-360型超声波清洗器(广东固态特超声股份有限公司)；RE-2000A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；ThermoFisher TSQ 9000型气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)(美国Thermofisher Scientific公司).

1.2 材料

实验所用中国云南香格里拉、中国云南丽江、中国云南曲靖、中国云南昆明、中国四川乐山、中国西藏林芝及秘鲁胡宁等7个产地的玛咖均购于云南省昆明市丰熙茶行；所用石油醚为分析纯，购于云南省景锐科技有限公司；所用正己烷为分析纯，购于天津市风船化学试剂科技有限公司.

2 实验方法

2.1 脂溶性成分的提取

称取10.0 g玛咖粉，加入石油醚(60～90 ℃)100 mL，超声提取(功率360 W、频率40 KHz)3次，每次1 h，过滤，减压浓缩，挥干.用正己烷溶解，过0.22 μm微孔滤膜，供后续GC-MS分析用.

2.2 GC-MS分析条件

色谱条件：进样口温度270 ℃；载气为高纯度氦气，柱前压9.785 3 psi，载气流速为1.0 mL/min；进样量1 μL；分流，分流比100∶1，分流流量120 mL/min.采用程序升温的方式分离脂溶性成分.初始温度50 ℃，以10 ℃/min速率升温至150 ℃；以1 ℃/min速率升温至180 ℃，保持3 min；以1 ℃/min速率升温至200 ℃；再以3 ℃/min速率升温至270 ℃，保持5 min.

质谱条件：离子源为EI源；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；电子能量70 eV；发射电流34.6 μA；溶剂延迟4 min；m/z范围40～550 amu.

3 结果与讨论

3.1 玛咖样品共有峰的确认及指纹图谱的确定

采用GC-MS得到7个产地的玛咖样品的数据，通过分析基峰和m/z，参考NIST MS Search 2.3质谱数据库检索结果及分析匹配度，对玛咖中的脂溶性成分进行定性分析；对GC-MS数据进行积分，结合峰面积归一化法计算共有成分的相对含量[16-17].

7个不同产地玛咖的脂溶性成分的GC-MS图谱如图1所示.通过谱库检索及图谱对照发现，在55 min处出现了面积较大的色谱峰，由于峰裂分较严重，经检索匹配度较低，因此并未对此峰进行积分分析.通过GC-MS在玛咖样品中共检测出91种挥发性成分，其中酰胺类和酯类在挥发性成分中含量最高，其次为酸类.结果显示：西藏林芝玛咖中脂溶性成分的峰面积较大，与其他6个产地的玛咖之间存在显著的差异.

图1 7个产地玛咖的脂溶性成分的GC-MS指纹图谱

选取了保留时间相差很小的15个共有峰作为研究对象，经NIST MS Search 2.3质谱数据库检索，都为相同脂溶性成分.7个产地玛咖的15个脂溶性成分的峰面积之和占总峰面积的百分比介于73.37%～88.86%之间.

由于保留时间为8.237 min的苯乙腈的峰面积较大且积分相对稳定，具有良好的参照效果，因此选择苯乙腈的色谱峰作为15个共有特征峰的参照峰，将苯乙腈的保留时间和相对峰面积都设定为1，在此基础上计算其他所有共有特征峰的保留时间和峰面积的相对保留值(见表1).从表1可知，7个产地的玛咖的15种脂溶性成分在GC-MS上的保留时间具有相对稳定性但峰面积相差较大.

表1 15种脂溶性成分色谱峰的相对保留面积

3.2 玛咖脂溶性成分的数字化特征指纹图谱

所构建的玛咖脂溶性成分的数字化特征指纹图谱如表2所示.从表2可知，脂溶性成分的指纹图色谱峰相对保留时间主要集中在0.954～10.531之间.表中结果说明,不同产地玛咖的同一种成分的保留时间差异较小，出峰稳定，相对含量具有一定差异，可以进行指纹图谱的构建及玛咖溯源.

表2 玛咖脂溶性成分的数字化指纹图谱

3.3 玛咖指纹图谱的相似度分析

采用夹角余弦法对7个产地玛咖样品的脂溶性成分的GC-MS 指纹图谱进行相似度分析.结果表明：15种脂溶性成分的色谱峰夹角余弦的相关系数在 0.900 1～0.989 4 之间，说明不同产地的玛咖样品具有较好的相似度，可用于建立新型的玛咖GC-MS指纹图谱.

3.4 主成分分析

由于7个产地的玛咖脂溶性成分共有特征峰具有一定的相似性，但脂溶性成分的相对含量不同，因此可采用PCA法对不同来源玛咖进行分析.其KMO为0.788，P为0.000，进一步表明这些数据适用于PCA法分析.

利用SPSS软件从表2的数据中提取3个主成分.表3给出了15个玛咖脂溶性成分的3个主要组成部分的特征.PC1为3-甲氧基苯乙腈，PC1的特征值和累积百分比分别为6.946和46.309%；PC2为亚油酸甲酯，PC2的特征值和累积百分比分别为4.121和27.474%；PC3为N-苄基十六烷酰胺，PC3的特征值和累积百分比为2.275和15.163%；总累计百分比为88.947%.

用等级来评估不同来源玛咖的质量，结果如表3所示.丽江玛咖得分为0.304，在这些样本中排名最高；而昆明玛咖得分为-0.095，在这些样本中得分最低.

表3 不同溯源玛咖样品中脂溶性成分的综合得分和排名

图2给出了采用PCA方法对这些样本进行进一步区分的直观图.从图中可以看出PCA法能够根据玛咖中3种主要的脂溶性成分的相对含量清晰的区分不同产地的玛咖.

PC1、PC2和PC3预测产地和主成分的相关性.

4 结语

运用GC-MS 对7个产地玛咖中的脂溶性成分进行了分析，采用峰面积归一化法计算了各成分的相对含量.检测到了15种主要的共有脂溶性成分，其中3-甲氧基苯乙腈、亚油酸甲酯及N-苄基十六烷酰胺等3种脂溶性成分的相对含量较高.

结合夹角余弦法及PCA法以相对含量稳定的 15 种脂溶性成分的特征值为指纹峰，建立了玛咖脂溶性成分的 GC-MS指纹图谱.特征峰的相似度均达到了 0.900 1以上，说明标准指纹图谱可以作为分析与鉴别玛咖的依据.分析表明，不同产地玛咖的脂溶性成分相对含量具有显著的差异；PCA法能够根据相对含量有效地对不同产地的玛咖进行鉴别.该方法为玛咖快速溯源提供了参考，也为玛咖质量分析与鉴定提供了依据.