复方蜥蜴散基于HIF-1α介导PI3K/AKT通路干预裸鼠胃癌浸润转移

李卫强 兰苗苗 景燕燕 朱西杰

(宁夏医科大学中医学院，宁夏 银川 750004)

胃癌是临床常见恶性肿瘤之一，中国胃癌发病率居男性全身恶性肿瘤第二位，女性第四位〔1，2〕。研究表明，病变位于黏膜层及黏膜下层早期胃癌的防治，可使患者5年生存率达90%以上〔3〕，而浸润转移是影响胃癌患者疗效及预后的主要原因之一。因胃癌早期症状隐匿，发病机制尚不完全清楚，故开展高效低毒的有效药物，特别是中医药抑制肿瘤浸润迁移的疗效及机制研究显示出其重要性和迫切性。本研究前期应用单味宁夏密点麻蜥及其为主组成的复方蜥蜴散治疗胃癌前病变及胃癌等有多年临床和实验研究基础〔4～10〕，证实密点麻蜥及复方蜥蜴散具有较好促进细胞凋亡，阻断癌变的作用。本研究旨在进一步观察复方蜥蜴散基于缺氧诱导因子(HIF)-1α介导磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路对上皮间质转化(EMT)的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物 120只SPF级4周龄BALB/c裸鼠，雄性，体重(18±2)g，合格证编号：SCXK(宁)2015-0001。裸鼠饲料(北京科澳协力饲料有限公司，合格证编号：18053223)。均由宁夏医科大学实验动物中心提供。

1.2药物及试剂 人SGC-7901胃腺癌细胞 (购自中国科学院上海生科院细胞资源中心)；复方蜥蜴散(密点麻蜥、黄芪、白术、半枝莲、延胡索、山楂、白芍、三七、鹿角胶、甘草等)由宁夏医科大学附属回医医院制剂室提供，煎成高、中、低浓度分别为0.27、0.13、0.06 g/ml药液备用；华蟾素(陕西东泰制药有限公司，Z20090846)：临用前用蒸馏水配成9 mg/ml的混合液；5-氟尿嘧啶(FU)注射液(天津金耀药业有限公司，1707051)：临用前将原液(0.25 g/10 ml)用生理盐水稀释10倍，备用；生理盐水(四川科伦药业股份有限公司，L118031403)；二甲苯(西陇科学股份有限公司，1330-20-7)；无水乙醇(西陇科学股份有限公司，64-17-5)；苏木素(索莱宝科技有限公司，517-28-2)；山羊血清(索莱宝科技有限公司，517-28-2)；辣根过氧化物酶(HRP)-山羊抗兔IgG(Jackson Immuno Research Inc，111-035-003)；蛋白G磁珠(Cell Signaling Technology，9006S)；蛋白质 Marker(Thermo Fisher Scientific，26634)；Tunel试剂盒(万类生物，WLA029)。

1.3主要仪器 石蜡切片机〔莱卡显微系统(上海)有限公司，RM2016〕；显微镜(尼康仪器有限公司，Eclipse Ci-L)；显微镜拍照系统(尼康仪器有限公司，Nikon DS-F12)等。

1.4造模 裸鼠适应性喂养后，采用人SGC-7901胃癌细胞株于裸鼠右侧腋窝皮下注射，制备胃癌移植瘤模型。经稳定传代6次后，当皮下移植瘤长至直径约10 mm，无菌操作下剥取移植瘤，将其切成1 mm×1 mm×1 mm组织块浸泡培养基内备用。裸鼠腹部消毒麻醉后，于腹正中剑突下切开约1.5 cm进腹，在胃大弯侧血管丰富区划开胃浆膜层成“十”字，接种胃癌组织块，OB胶覆盖伤口后关腹，制备胃癌原位移植瘤模型。继续饲养观察4 w，期间观察裸鼠活动、皮色、进食、体重、腹部体征等；分别于第8、15、22天选择裸鼠处死剖腹探查了解成瘤情况，以肿瘤最大直径约1 mm时为模型制备成功。

1.5分组及给药 将造模成功裸鼠胃癌移植瘤模型随机分为6组：模型对照组、华蟾素阳性对照组、5-Fu阳性对照组、复方蜥蜴散低剂量组(0.06 g/ml)、中剂量组(0.13 g/ml)、高剂量组(0.27 g/ml)。除模型对照组外，其余各组按照0.4 ml/20 g灌胃给药，1次/d，连续给药6 w后停药，给药期间观察裸鼠活动、皮色、进食、体重、腹部情况等，模型对照组给予等量生理盐水。干预治疗结束24 h后，处死各组裸鼠，观察裸鼠腹腔内瘤体情况，取肿瘤组织进行相关实验检测。

1.6Western印迹检测HIF-1α、PI3K、p-AKT、AKT及EMT相关蛋白E-钙黏蛋白(cadherin)、整联蛋白(Integrin)-β3表达水平 将所取组织块剪成小块，按照每100 mg组织加入1 ml左右冷裂解液至其完全裂解后，离心取上清，即为全蛋白提取物。分装保存于-80℃冰箱，避免反复冻融。用二喹啉甲酸(BCA)试剂盒进行蛋白定量。经蛋白样品变性、电泳、转膜、封闭显影等，采集图像，分别计算目的蛋白的灰度值。

1.7TUNEL检测胃癌细胞凋亡 将肿瘤组织置于10%甲醛溶液中固定48 h，经冲洗、包埋、梯度浓度酒精脱水、切片、脱蜡。最后用抗荧光衰减封片液封片后荧光显微镜下观察。

1.8统计学方法 采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析、最小显著差异(LSD)t检验和秩和检验。

2 结 果

2.1免疫组织化学法检测HIF-1α、PI3K、p-AKT、Integrin-β3及EMT相关蛋白表达 在细胞核或细胞质中可见相关蛋白阳性表达，呈棕黄色。与模型对照组比较，药物干预组HIF-1α、PI3K、p-AKT、Integrin-β3相关蛋白表达水平显著降低，E-cadherin表达水平显著升高(P<0.05)；与华蟾素、5-Fu阳性对照组比较，复方蜥蜴散不同剂量组HIF-1α、PI3K、p-AKT、Integrin-β3相关蛋白表达水平显著降低，E-cadherin表达水平显著升高(P<0.05)；与复方蜥蜴散低、中剂量组比较，高剂量组相关蛋白表达水平差异有统计学意义(P<0.05)。见图1、表1。

图1 各组相关蛋白表达比较(免疫组化，×400)

2.2TUNEL检测各组药物对细胞凋亡影响 凋亡细胞的细胞核内经染色呈黄色或棕黄色。与模型对照组比较，药物干预组细胞凋亡率显著增加(均P<0.05)；与华蟾素、5-Fu阳性对照组比较，复方蜥蜴散不同剂量组细胞凋亡率显著增加(P<0.05)；与复方蜥蜴散低、中剂量组比较，高剂量组诱导细胞凋亡率显著增加(P<0.05)。见表1、图2。

2.3Western印迹检测HIF-1α、PI3K、p-AKT、AKT及EMT相关蛋白E-cadherin、Integrin-β3表达 与模型对照组比较，药物干预组各组HIF-1α、PI3K、p-AKT、Integrin-β3表达水平显著降低(P<0.05)，E-cadherin表达水平显著升高(P<0.05)；与华蟾素、5-Fu阳性对照组比较，复方蜥蜴散不同剂量组各组E-cadherin表达水平显著升高(P<0.05)，HIF-1α、PI3K、p-AKT、Integrin-β3表达水平显著降低(P<0.05)；与复方蜥蜴散低、中剂量组比较，高剂量组E-cadherin表达水平显著升高(P<0.05)，HIF-1α、PI3K、p-AKT、Integrin-β3表达水平显著降低(P<0.05)。各组AKT表达差异无统计学意义(P>0.05)。见表2、图3、图4。

表1 各组胃癌细胞凋亡率及HIF-1α、PI3K、p-AKT、E-cadherin、Integrin-β3表达光密度值比较

图2 各组胃癌细胞凋亡(TUNEL，×400)

表2 各组HIF-1α、PI3K、p-AKT、E-cadherin、Integrin-β3表达比较

1～6：模型对照组、华蟾素阳性对照组、5-Fu阳性对照组、复方蜥蜴散低剂量组、复方蜥蜴散中剂量组、复方蜥蜴散高剂量组；下图同图3 各组HIF-1α、PI3K、p-AKT、AKT阳性表达

图4 各组E-cadherin、Integrin-β3表达

3 讨 论

细胞缺血缺氧微环境改变是胃癌发生发展过程中的普遍现象，而细胞生存微环境改变导致EMT发生是胃癌浸润迁移的主要原因。因此，改善缺血缺氧微环境，阻断EMT是防治胃癌、阻断浸润迁移的关键环节。《医宗全鉴》对胃癌病因、症状有详细阐述：“三阳热结，谓胃、小肠、大肠三府热结不散，灼伤津液也。胃之上口为贲门，小肠之上口为幽门……贲门干枯，则放出腐化之道路狭隘，故食入反出为翻胃也”〔11〕。本研究表明，毒瘀交阻是胃癌前病变、原位胃癌主要病机，并通过检测胃癌前病变患者甲皱微循环，表明在管袢形态、管袢流态、管袢状态方面存在不同程度异常、络脉瘀滞、胃黏膜下血液的高凝状态及细胞缺血缺氧微环境的改变〔12〕。因此，毒瘀交阻致脉络瘀阻、黏膜缺血缺氧而失濡养，久则成癥瘕即胃癌，中西医病机一致。

研究表明，EMT是癌变浸润迁移极其重要的基础，PI3K/AKT信号通路与多种恶性肿瘤形成及发展密切相关，是调控EMT主要信号通路，而缺血缺氧微环境改变是诱导EMT、促进胃癌发生及浸润迁移的重要现象，其中基质金属蛋白酶(MMPs)是维持细胞上皮表型的重要分子〔13～17〕。任何肿瘤在生长过程中，局部都会出现缺血缺氧状态，肿瘤细胞存在着对缺血缺氧的自身调节，其机制主要是通过激活HIF-1α，参与提高葡萄糖转运、糖酵解及肿瘤血管生成，为其浸润生长提供必要条件。有学者认为，活性氧(ROS)与HIF-1α共同作用于胃黏膜，引起胃癌的发生〔18，19〕。因此，HIF-1α与胃癌发生及浸润迁移关系密切。且PI3K/AKT等信号通路已被研究与HIF-1α介导的EMT密切相关〔16，20〕。

复方蜥蜴散以解毒通络立法，应用密点麻蜥为君药，破结利水、消瘿散结，《中国药用动物志》〔21〕：“蜥蜴可以活血祛瘀。”其性寒，味咸，归肺、肝、肾三经，是血肉有情之躯，具有养血活血、消瘿祛瘀散结的功效，能够促进血液循环。主要见于宁夏地区，属于草原荒漠蜥蜴。《本草纲目》记载，蜥蜴可“消水饮阴癀，滑窍破血”。研究表明，蜥蜴富含蛋白质、多肽类、氨基酸和脂肪及铝、钡、钙、镉、铬、铜、钴、铁、镍、镁、锰、锌等多种微量元素，可以起到抗癌的作用，并能提高机体免疫力、促进胃黏膜再生修复。黄芪、白术、半枝莲、延胡索、山楂、白芍为臣药益气养阴，和胃通络、扶正抗癌；三七、鹿角胶为使药，温阳通络，改善黏膜血液循环；甘草为佐，调和诸药。各药共用，补阴益气、解毒通络、增强免疫力、扶正抗癌。缪希雍《先醒斋医学广笔记》指出：“汤者，荡也，去大病用之；散者，散也，去急病用之”。《临证指南医案》云：“细末者不循经络，止去胃中及脏腑之积。”基于此认识，本研究组成复方蜥蜴散粉碎成散剂颗粒，临床应用疗效较好。

综上，复方蜥蜴散解毒通络通过增加黏膜血流，改善氧供，激活HIF-1α，介导PI3K/AKT信号通路，进而影响EMT相关蛋白表达，可有效促进肿瘤细胞凋亡，阻断胃癌浸润转移，为临床中医药抗癌应用提供科学依据。