肾上腺素对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、迁移的影响及其相关机制

于桂发 张璞微 吴春霞 樊晨星 李昆

(锦州医科大学附属第一医院,辽宁 锦州 121000)

乳腺癌已经成为现代女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率位居女性恶性肿瘤之首〔1,2〕。三阴性乳腺癌是乳腺癌的一种特殊亚型，其特征是雌激素受体、孕激素受体、人表皮生长因子受体均为阴性〔3,4〕。与其他亚型的乳腺癌相比，三阴性乳腺癌具有恶性程度高、侵袭转移能力强等特点〔5〕。三阴性乳腺癌的发生发展受多种因素的影响，除了临床治疗方面的影响外，患者本身的个体因素也可能会影响乳腺癌的进程〔6〕。大多数三阴性乳腺癌患者在临床治疗过程中情绪上会产生较大波动，一般体现为焦虑、恐惧、抑郁等不良情绪反应〔7〕。长期处于这种不良情绪中会导致机体神经内分泌系统功能失调，肾上腺素等应激激素分泌增多〔8,9〕。但异常分泌的肾上腺素是否对三阴性乳腺癌的发生发展产生一定的影响却鲜有研究。本研究旨在探讨肾上腺素对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、迁移的影响及其相关机制。

1 材料与方法

1.1材料 MCF-10A、MDA-MB-231细胞均购自南京凯基生物有限公司。L15不完全培养基购自南京凯基生物有限公司；DMEM高糖培养基购自美国Hyclone公司；胎牛血清购自德国Serana公司；青-链霉素、0.25%胰蛋白酶消化液均购自武汉普诺赛生命科技有限公司；磷酸盐缓冲液(PBS)、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)配制试剂盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒、超敏化学发光(ECL)显影液、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)、GAPDH均购自上海碧云天生物技术有限公司；牛血清白蛋白(BSA)购自北京索莱宝科技有限公司；细胞外调节蛋白激酶(ERK)1/2、P-ERK1/2抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；C-MYC、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9抗体均购自沈阳万类生物科技公司；Anti-ADRB2抗体购自Affinity Biosciences公司；肾上腺素粉末购自上海江莱生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 人乳腺癌MDA-MB-231细胞培养于10%胎牛血清、1%青链霉素的L15不完全培养基中，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。

1.2.2MTS法检测肾上腺素对MDA-MB-231增殖能力的影响 将对数期生长的细胞消化后制成细胞悬液，按照8×103个/孔的细胞数量将细胞铺入96孔板中，放入37℃，5%CO2培养箱中过夜。吸出旧液，加入配制好的各浓度肾上腺素溶液(现用现配)，同时设置空白组、对照组；继续培养，分别在12、24、36、48、72 h时采用细胞增殖与毒性检测试剂盒(MTS)法检测各分组吸光度(A)值，计算细胞增殖率。

1.2.3划痕实验检测肾上腺素对MDA-MB-231细胞迁移能力的影响 选用0.010、0.100、0.100、1.000、10.000 μmol/L 5种浓度作为代表评估肾上腺素对MDA-MB-231细胞迁移的影响。将对数期生长的细胞消化后制成细胞悬液，按照8×104个/孔的细胞数量将细胞铺入6孔板中，放入37℃，5%CO2培养箱中过夜。待长成单层后，用200 μl枪头在每个孔中间划“+”字，将旧液吸出，用PBS将脱落的细胞洗净，每孔加入3 ml无血清的L15不完全培养基，用封口膜将盖板封好，使用普光显微镜进行加药前拍照。吸出培养液，依次加入用无血清L15不完全培养基配制好的各浓度肾上腺素，对照组不加药，加药后放入培养箱中培养，分别在加药后12、24、36、48 h进行拍照，拍照方式同前，每次拍照时尽量与上次拍照位置保持一致。

1.2.4Western印迹检测人正常乳腺上皮细胞MCF-10A与MDA-MB-231细胞表面β2肾上腺素受体(ADRB2)表达情况 将对数期生长的MDA-MB-231细胞和MCF-10A细胞消化后制成悬液，分别收样于EP管中，5 500 r/min离心5 min后每管加入含有PMSF的细胞裂解液100 μl,涡旋混匀后静置于冰上使其充分裂解后提取总蛋白。对各组提取的蛋白进行定量后，分别吸取等量的蛋白进行SDS-PAGE，通过湿转法将蛋白转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，BSA封闭,加入一抗，4℃过夜，TBST洗膜，加入二抗,室温下孵育1 h，TBST洗膜后加入ECL进行显色，使用自动电泳凝胶成像仪采集图像，分析条带灰度值。

1.3Western印迹检测ERK信号转导通路及其下游相关蛋白C-MYC、MMP2、MMP9表达情况 选用0.1 μmol/L的肾上腺素作为代表来评估肾上腺素对靶蛋白表达情况的影响。将加药处理后的MDA-MB-231细胞消化后收样于EP管中，另设不加药物的对照组，离心后每管加入含有PMSF的细胞裂解液100 μl,涡旋混匀后静置于冰上使其充分裂解提取总蛋白。定量后，分别吸取等量的蛋白进行SDS-PAGE，通过湿转法将蛋白转移至PVDF膜上，BSA封闭,加入一抗，4℃过夜，TBST洗膜，加入二抗，室温下孵育1 h，TBST洗膜后加入ECL进行显色，使用自动电泳凝胶成像仪采集图像，分析条带灰度值。

1.4统计学方法 采用SPSS17.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1人正常乳腺上皮细胞MCF-10A与MDA-MB-231细胞表面ADRB2表达情况 与人正常乳腺上皮MCF-10A细胞(0.091±0.018)相比，MDA-MB-231细胞表面ADRB2表达水平(0.133±0.015)明显升高(P=0.028 7)。见图1。

图1 人正常乳腺上皮细胞MCF-10A与人乳腺癌 MDA-MB-231细胞表面ADRB2

2.2肾上腺素对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响 肾上腺素对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响 浓度为0.001、0.010、0.100、1.000、10.000、20.000、40.000、60.000、80.000 μmol/L的肾上腺素在分别作用36 h后，其增殖率分别为(119.30±7.25)%、(115.01±2.52)%、(119.08±5.04)%、(113.80±1.79)%、(110.19±1.10)%、(108.41±1.08)%、(108.36±0.49)%、(108.29±2.37)%、(108.33±2.38)%，与对照组(100.00±0.00)%相比，上述浓度的肾上腺素都能明显促进MDA-MB-231细胞的增殖(P<0.01)，但肾上腺素对MDA-MB-231细胞的这种促增殖作用并未呈现出明显的浓度依赖性；浓度为0.100 μmol/L的肾上腺素在分别作用12、24、36、48、72 h后，其增殖率分别为(120.38±17.66)%、(120.29±3.07)%、(119.08±5.04)%、(113.66±4.83)%、(110.60±7.94)%，肾上腺素对MDA-MB-231细胞的这种促增殖作用并未呈现出明显的时间依赖性。浓度为100.000、500.000、1 000.000、5 000.000 μmol/L的肾上腺素在分别作用36 h后，其增殖率分别为(96.55±1.61)%、(90.61±0.78)%、(63.17±5.37)%、(37.59±4.33)%，与对照组相比，上述浓度的肾上腺素都能明显抑制MDA-MB-231细胞的增殖(P<0.01)，且这种增殖抑制作用具有浓度依赖性。

2.3肾上腺素对乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移能力的影响 肾上腺素对乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移能力的影响 浓度为0.001、0.010、0.100、1.000、10.000 μmol/L的肾上腺素在分别作用36 h后，其迁移率分别为〔(82.83±4.71)%、(74.05±3.83)%、(77.07±6.09)%、(79.31±2.80)%、(81.35±1.21)%〕，与对照组的迁移率〔(60.64±1.12)%〕相比，上述浓度的肾上腺素都能明显促进MDA-MB-231细胞的迁移(P<0.01)，但并未发现肾上腺素的这种促迁移作用呈现出明显的浓度依赖性；浓度为0.100 μmol/L的肾上腺素在分别作用12、24、36、48 h后，其迁移率与对照组迁移率的比值分别为1.28±0.02、1.28±0.03、1.22±0.01、1.19±0.02，肾上腺素对MDA-MB-231细胞的这种促迁移作用并未呈现出明显的时间依赖性。见图2、图3。

图2 不同浓度肾上腺素对人乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移的影响(×100)

图3 肾上腺素作用不同时间对人乳腺癌 MDA-MB-231细胞迁移的影响(×100)

2.4ERK信号转导通路相关蛋白表达情况 与对照组相比，肾上腺素组总ERK1/2表达量无明显变化，但肾上腺素可以明显上调P-ERK1/2的表达(P<0.05)。见表1、图4。

表1 肾上腺素作用前后人乳腺癌MDA-MB-231 细胞中ERK1/2及P-ERK1/2表达

图4 肾上腺素作用前后人乳腺癌MDA-MB-231 细胞中ERK1/2及P-ERK1/2表达

2.5ERK信号通路下游C-MYC、MMP-2、MMP-9蛋白表达情况 与对照组相比，肾上腺素可以明显地上调C-MYC、MMP-2、MMP-9表达(P<0.01，P<0.001)。见图5、表2。

图5 肾上腺素作用前后人乳腺癌MDA-MB-231细胞中 C-MYC、MMP-2、MMP-9表达

表2 肾上腺素作用前后人乳腺癌MDA-MB-231细胞中 C-MYC、MMP-2、MMP-9表达情况

3 讨 论

研究显示，一定浓度范围内的肾上腺素能够促进人乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖与迁移。肾上腺素可以与肾上腺素受体结合，改变细胞内第二信使水平，启动一系列级联反应最终将细胞外信号传递到细胞内的效应器上产生相应的生物学效应〔10,11〕。肾上腺素受体作为G蛋白耦联受体家族中的成员之一，具有多种亚型。肾上腺素受体分为α受体和β受体，而在不同细胞株表面这两种受体的亚型的表达强度又不尽相同〔12～14〕。以往的研究显示，MDA-MB-231细胞表面存在着大量的ADRB2〔15,16〕。本研究结果推测，肾上腺素可能与MDA-MB-231细胞表面表达的ADRB2结合，从而启动细胞内相应的信号通路，最终促进人乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖与迁移。

ERK信号通路是一种经典的调控细胞增殖与迁移的信号调节通路，肾上腺素可以与细胞膜表面的ADRB2结合，通过一系列级联反应激活ERK信号通路，使ERK1/2磷酸化水平升高，并对其下游与细胞增殖、迁移有关的蛋白进行调控，从而促进细胞的增殖与迁移〔17〕。因此，推测肾上腺素促进人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖与迁移是在细胞表面的ADRB2的介导下通过激活ERK信号通路，最终促进人乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖与迁移。

综上，肾上腺素可以在MDA-MB-231细胞表面ADBR2的介导下通过调控ERK信号通路及其下游相关蛋白c-myc、MMP-2、MMP-9来促进乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖与迁移。长期处于不良情绪状态下的三阴性乳腺癌患者体内肾上腺素分泌异常〔18,19〕，因此，临床上在对待三阴性乳腺癌患者时，要注意观察这类患者的情绪变化，及时进行心理干预，尽可能减少肾上腺素的异常分泌，从而对临床乳腺癌的治疗起到一定辅助作用。