miR-29b过表达对动脉硬化模型大鼠干预作用及机制

池魁 袁涛 孙欢欢 李烨 张金文

(河北医科大学第二医院 1血管外科，河北 石家庄 050000；2麻醉科)

动脉硬化属于动脉非炎症性及退行性的病变，常表现为动脉管壁出现增厚及变硬以及血管弹性降低〔1〕。在20世纪60年代，欧美等发达国家，动脉硬化大幅度增加，进而成为一种常见病〔2〕。随着我国社会的发展，人们生活节奏、生活方式的改变及老龄化的加重，动脉硬化在我国发病率显著升高〔3〕。目前，动脉硬化作为不良心血管事件出现的独立危险因素，已成为老年人死亡的主要原因之一〔4〕。miRNA属于短的单链RNA序列，在生物系统中广泛表达，能够控制基因在多种生理与病理过程中的表达，具有调控转录后的关键作用〔5〕。miRNA参与在细胞增殖、凋亡及胚胎发育等多种过程中〔6〕。但目前关于miR-29b与动脉硬化的相关性研究还未见报道。本研究探讨miR-29b过表达对动脉硬化模型大鼠的干预作用及机制。

1 材料与方法

1.1材料 选取40只SD健康雌性大鼠，由上海斯莱克动物实验中心所提供，月龄8～11个月，平均(9.5±1.2)个月，体重219～246 g，平均(231.5±11.07)g。在相对湿度30%～36%、温度为(23.5±1.3)℃的环境下，对大鼠进行喂养1 w，光照12 h/d。本文研究获医院伦理委员会批准。

miR-29b(Sigma公司)；磷酸盐缓冲液(PBS)及聚苯乙烯试管(Invitrogen公司)；一氧化氮(NO)、内皮素(ET)-1及白细胞介素(IL)-8试剂盒(Abcam公司)；转化生长因子(TGF)-β1及单核细胞趋化蛋白(MCP)-1抗体(Millipore公司)；枸橼酸缓冲液(Cell Signaling公司)。内皮生长因子(VEGF)及鳞状细胞癌抗原(SCC)抗体及苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(碧云天公司)酶标仪(美国AI公司)

1.2建模及分组 将40只SD雄性大鼠随机分为正常组，疾病模型组、miR-29b过表达组及miR-29b沉默组各10只。其中正常组不进行任何处理，自由饮食。疾病模型组、miR-29b过表达组及miR-29b沉默组建立动脉硬化大鼠模型，首先以高脂饲料进行喂养1 w，后在清洁室内以1%戊苯巴比妥钠，在大鼠腹腔进行麻醉，每只大鼠对左后肢进行消毒后，以腹腔沟中点向后肢内侧进行纵行切肤，在分离后将引动脉暴露，使用动脉夹在隐动脉远近端在1.5～2.0 cm进行阻断，使用胰岛素注射器沿隐动脉血管的长轴在远端及近端刺进阻断部位血管，在血管充盈止，在5 min后将针头及动脉夹进行压迫止血，缝合好伤口后，出现内膜损伤后，提示模型完成后。其中随机选取10只大鼠为疾病模型组，不进行任何处理。余下20只miR-29b沉默组进行注射0.2 μl/gmiR-29b抑制剂，miR-29b过表达组进行注射0.2 μl/g miR-29b类似物。

1.3HE染色 待测标本首先进行脱蜡、水化等处理之后，将其在0.01 mol/L、95℃的枸橼酸缓冲液中浸泡，同时进行热修复，选择在3%H2O2环境下培育10 min，滴入山羊血清，26℃环境中进行培养30 min，抽离封闭液后，添加一抗，将其放置在5℃的环境中过夜培养，第2天置入二抗，在37℃恒温箱中培养30 min，清洗后进行二氨基联苯胺(DAB)显色及封片。

1.4反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测miR-29b表达 首先提取细胞总RNA，检测其RNA纯度及含量，逆转录处理后获得cDNA，设计引物序列，以2-△△Ct方法计算miR-29b表达，PCR引物以Primer Premier6.0软件进行设计(Invitrogen公司合成)。其中miR-29b上游引物：5′-GCGCGCTAGCACCATTTG-3′，下游5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′。

1.5VEGF、TGF-β1及MCP-1水平检测 免疫组化法检测VEGF、TGF-β1及MCP-1水平，以PBS作为阴性对照，以CK19>10 μg/L为阳性判断标准，当细胞膜或细胞质呈棕黄色或棕褐色为CK19染色阳性信号。将组织蜡块进行石蜡切块，将厚度切为4 μm，以常规脱蜡、脱水，进行抗原修复，除去离子水孵化，并滴加细胞间黏附分子(ICAM)-1为一抗，在4℃置放12 h，进行2次PBS清洗，同时滴加聚合梅辅助剂，在37℃下水浴，进行持续孵化，时间为20 min；2次PBS清洗，并进行滴加免疫球蛋白(Ig)G多聚体。在37℃下水浴，进行持续孵化，时间为30 min。

1.6NO、ET-1及IL-8水平检测 以酶联免疫吸附试验检测NO、ET-1及IL-8水平，将50 mm碳酸盐包缓冲液稀释后在聚苯乙烯的反应孔内加入，并进行抗原，加盖处理，选择4℃冰箱内放置24 h，次日行3次洗涤，后抛干，将稀释液(pH值为7.4 0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液)稀释的待测标本0.1 ml放入每个孔中，同时放入阳性和阴性对照标本，存放在摄氏度42℃环境中60 min，移除液体后，进行3次洗涤并抛干，在每个孔中放入NO、ET-1及IL-8抗体0.1 ml，存放60 min，移除液体后。进行3次洗涤并抛干，在每个孔中放入低物液(0.1 mol/L的Na2HPO4,0.05 mol/L的枸橼酸)，混匀之后放入0.1 ml邻苯二胺，进行20 min遮光，再一次放入2 mol/L H2SO40.05 ml放置在每个孔内，终止反应。以酶标仪检测A450值检测NO、ET-1及IL-8水平。

1.7ROS、MDA及SOD水平检测 应用黄嘌呤氧化酶法检测ROS、MDA及SOD水平，取用聚苯乙烯试管，将其分为测量管、对照管。提取样品后，于上清中加蒸馏水，体积是上清的10倍，将样品配制为浓度1%。测量管、对照管内均加1.0 ml试剂盒中的试剂，分别在试剂1、2、3、4中加0.1 ml，后在测量管加入样品50 μl，在对照管内加50 μl蒸馏水，待加样后，将试管放旋涡混匀器开始充分混匀，于37℃恒温水浴箱中保存40 min。显色：在对照管、测量管中各加2 ml显色剂，室温放置10 min。使用蒸馏水调零分光光度计算，比色需要在波长550 nm，1 cm光径条件下。

1.8统计学处理 采用SPSS21.0软件进行F检验。

2 结 果

2.1HE染色 正常组组织结构正常，内膜较为光滑平整，且内皮细胞排列有序，疾病模型组内膜明显增厚，细胞排列紊乱，可见较多迁移的平滑肌细胞；miR-29b沉默组内膜较为明显增厚，细胞排列严重紊乱，可见较多迁移的平滑肌细胞；miR-29b过表达组内皮细胞排列出现有序，相比疾病模型组迁移的平滑肌细胞较少。见图1。

2.2VEGF水平及miR-29b表达比较 与正常组相比，疾病模型组、miR-29b沉默组及miR-29b过表达组miR-29b表达明显低，VEGF水平明显高(P<0.05)；与疾病模型组相比，miR-29b沉默组miR-29b表达明显低，VEGF水平明显高，miR-29b过表达组miR-29b表达明显高，VEGF水平明显低(P<0.05)。见表1。

2.3NO、ET-1水平比较 与正常组相比，疾病模型组、miR-29b沉默组及miR-29b过表达组NO水平明显低，ET-1水平明显高(P<0.05)；与疾病模型组相比，miR-29b沉默组NO水平明显低，ET-1水平明显高，miR-29b过表达组NO水平明显高，ET-1水平明显低(P<0.05)。见表2。

图1 各组组织HE染色(×200)

表1 各组VEGF水平及miR-29b表达比较

表2 各组NO、ET-1水平比较

2.4ROS、MDA及SOD水平比较 与正常组相比，疾病模型组、miR-29b沉默组及miR-29b过表达组ROS、MDA水平均明显高，SOD水平明显低(P<0.05)；与疾病模型组相比，miR-29b沉默组ROS、MDA水平均明显高，SOD水平明显低，miR-29b过表达组ROS、MDA水平均明显低，SOD水平明显高(P<0.05)。见表3。

2.5TGF-β1、MCP-1及IL-8水平比较 与正常组相比，疾病模型组、miR-29b沉默组及miR-29b过表达组TGF-β1、MCP-1及IL-8水平均明显高(P<0.05)；与疾病模型组相比，miR-29b沉默组TGF-β1、MCP-1及IL-8水平均明显高，miR-29b过表达组TGFβ1、MCP-1及IL-8水平均明显低(P<0.05)。见表3。

表3 各组ROS、MDA、SOD及TGF-β1、MCP-1及IL-8水平比较

3 讨 论

动脉硬化作为危害人类健康的一大类疾病，常多发于老年人群〔7〕。目前，关于动脉硬化的治疗，常通过进行药物干预，但长期进行西药治疗，不良反应较多，严重甚至能够造成心动过缓及心律失常等〔8〕。miR在生物系统中广泛表达，能够控制基因在生理及病理过程中表达〔9〕。随着对miR研究的不断进步，发现在细胞周期的调节、分化、增殖与凋亡及血管生成中均有参与〔10〕。相关研究显示，miR还在代谢疾病、癌症及心血管疾病等多种人类疾病的病因中有着密切联系〔11〕。

miR-29家族是在2001年被发现，其中包括miR-29a、miR-29b及miR-29c，在调节细胞增殖、分化、免疫反应、组织纤维化及神经成熟、肿瘤形成和转移等较多的生理过程中均有参与〔12〕。相关研究显示，通过增加小鼠外源性miR-29b能够抑制心脏纤维化，同时改善心功能〔13〕。在肾脏纤维化中，通过上调miR-29b表达，能够显著减轻肾脏纤维化。血清中的miR-29b表达量在脑血管疾病中较高，能够促进血管平滑肌钙化，同时促进内皮细胞的增殖，使斑块快速破裂。VEGF能够促使内皮细胞进行分裂与增殖，同时促进炎性细胞在血管壁进行黏附，进而加重动脉硬化病情〔14〕。本研究结果说明，miR-29b参与动脉硬化的发生发展，且过表达miR-29b能够抑制动脉硬化病情进展。在动脉硬化中伴有明显的血管内皮损伤，当出现内皮损伤时，内皮细胞含量开始发生变化，其中ET-1与NO均由内皮细胞所分泌，两者均是能够直接反映出现内皮功能紊乱重要标志物〔15〕。相关研究显示，当NO/ET-1出现失衡，将导致出现血管内皮功能紊乱，进而出现动脉粥样硬化〔16〕。ET-1在内皮受损时含量将会明显增加，能够收缩血管、促进平滑肌增殖等，NO能够舒张血管，抑制平滑肌增殖，是抑制动脉硬化的内皮保护因子〔17〕。本研究结果说明，miR-29b过表达能够减轻动脉硬化中血管内皮损伤，改善内皮功能。动脉硬化作为由多种因素所诱发的综合性疾病，氧化应激在其中具有重要作用〔18〕。能够在早期促进动脉硬化形成脂质条纹、损伤血管内皮细胞、促进炎症因子的释放等〔19〕。在氧化应激过程中能够产生较多的氧自由基，对内皮造成损伤。其中，ROS能够反映出集体氧自由基总量，MDA能够反映出机体内脂质过氧化程度,SOD能够对氧自由基进行清除。相关研究显示，当机体内出现ROS与MDA增多，SOD较少，能够使血管内皮出现氧化损伤，并促进动脉粥样硬化的进展〔20〕。本研究结果说明，miR-29b过表达能够减轻动脉硬化大鼠中氧化应激损伤。炎症因子的表达在动脉硬化进展中有着关键作用。其中炎症因子不仅能够导致血管内皮损伤加重，同时随着病情的发展，能够促进动脉硬化的加速形成〔21〕。其中TGF-β1能够促进血管中内皮细胞的分裂，当巨噬细胞受到刺激，进而释放出大量的MCP-1，使得大量MCP-1在血管内膜聚集，进而导致动脉硬化发生发展得到加重。IL-8为关键的慢性血管促炎因子，能够通过趋化及激活中性粒细胞及分泌黏附分子，在动脉硬化过程中进行参与〔22〕。本研究结果说明，miR-29b过表达能够抑制炎症反应及动脉硬化的形成。

综上，在动脉硬化模型大鼠中，miR-29b明显参与其中，通过进行过表达miR-29b干预，能够抑制动脉硬化病情进展，减轻炎症反应及氧化应激损伤，改善内皮功能，且能够抑制动脉硬化的形成。