遗传代谢病检测技术及应用选择

韩连书

上海交通大学医学院附属新华医院 上海市儿科医学研究所 儿内分泌遗传代谢科（上海 200092）

罕见病种类繁多，包括各种器官畸形、综合征及功能缺陷疾病。遗传代谢病（inherited metabolic disease，IMD）又称先天性代谢异常（inborn errors of metabolism,IEM），属于功能缺陷型罕见病，是由于基因变异引起维持正常代谢所必需的酶、受体、载体等蛋白功能缺陷，导致中间或旁路代谢产物蓄积或终末代谢产物缺乏，引起一系列临床症状的一类单基因遗传病[1]。大部分IMD属于常染色体隐性遗传，总体发病率约1/5000～1/1400[2]。IMD临床表现复杂，缺乏特异性，全身各器官均可受累。其分类方式多样，如根据代谢物可分为氨基酸代谢异常、碳水化合物代谢异常、脂肪酸氧化障碍、尿素循环障碍、有机酸代谢异常、维生素代谢异常及金属元素代谢障碍等[3]；根据受累的细胞器可分为溶酶体病、线粒体病及过氧化物酶体病等。IMD 种类繁多，涉及体内代谢途径广泛，病因复杂，其确诊和分型依赖各种检测。常规生化检测如血常规、尿常规、血糖、肝功能、肾功能、电解质、血气分析、血氨、乳酸及肌酸激酶等项目出现异常，不能确定某种疾病，但可为IMD的诊断提供线索，判断病情程度。如血肌酸激酶增高，则需要鉴别是否为脂肪酸氧化代谢病、肌营养不良及甘油酸激酶缺乏症等。

1 特殊生化检测技术

1.1 免疫荧光检测技术

免疫荧光检测技术包含化学发光免疫分析法和放射免疫分析法。其中化学发光免疫分析法广泛用于新生儿筛查中促甲状腺素、17-羟孕酮、苯丙氨酸、葡萄糖6-磷酸脱氢酶检测。该技术还可通过在外周血白细胞或羊水细胞加入底物，计算产物与底物的比值得出酶活性，作为诊断溶酶体贮积病的金标准，如戈谢病需检测β-葡糖苷酶活性、法布累病应检测α-半乳糖苷酶活性、尼曼皮克病需检测酸性鞘磷脂酶活性，且酶活性检测是黏多糖贮积病分型的重要依据[2]。现已有部分地区开始利用此技术进行新生儿溶酶体疾病的筛查[4]。另外该技术也广泛应用于四氢生物蝶呤还原酶缺乏症、生物素酶缺乏症及酮氧化酶缺乏症等疾病的诊断。

1.2 串联质谱检测技术

串联质谱技术(tandem mass spectrometry,MS/MS)因其特异性高、同时准确区分及定量多种代谢物等特点，可用于遗传代谢病的筛查、诊断及治疗随访检测。该技术通过检测滤纸干血斑中氨基酸、酰基肉碱、同型半胱氨酸及不同类型类固醇激素等物质的质荷比（质量数/所带电荷数）对其进行定性及定量分析[5]，其优点在于检测方法快速、特异性强，可在2～3 分钟内对1 个3 mm 滤纸干血斑中几十种代谢产物进行分析，对多种氨基酸、有机酸、脂肪酸氧化代谢紊乱的疾病及类固醇激素相关代谢病进行新生儿筛查、临床患者的诊断及鉴别诊断。该项技术除了可实现一个血斑一次实验检测多种疾病[6]，并可设置相关氨基酸及酰基肉碱间的比值，进一步降低检测的假阳性率和假阴性率。1990年美国Millintong 等[5]首次将此技术用于IMD 的检测。2002 年上海新华医院率先将其应用于新生儿疾病筛查及临床患者检测[7]，目前串联质谱技术已广泛用于新生儿氨基酸代谢障碍、有机酸血症、脂肪酸氧化代谢障碍、先天性肾上腺皮质增生症、溶酶体疾病及X-连锁肾上腺脑白质营养不良的筛查[8-11]，并形成了新生儿疾病串联质谱筛查技术专家共识[12]。

1.2.1 血氨基酸谱检测 氨基酸水平测定是诊断IMD 的重要方法，尤其是与氨基酸代谢障碍相关。但血液中氨基酸水平受诸多因素影响，包括年龄、营养状况、生理变化、疾病及治疗情况等，因此氨基酸结果分析应结合临床进行综合评估。部分氨基酸代谢病患者尿中特异的有机酸可增高，因此血中某些氨基酸增高结合其相应的尿有机酸增高更有助于诊断。如酪氨酸血症不仅血酪氨酸、酪氨酸与苯丙氨酸比值增高，同时尿4-羟基苯乳酸和4-羟基苯丙酮酸也可增高。

1.2.2 酰基肉碱谱检测 酰基肉碱是脂肪酸、有机酸代谢的中间产物，多种脂肪酸和有机酸代谢异常均伴有肉碱和酰基肉碱的改变。如血游离肉碱降低可提示原发性肉碱缺乏或继发性肉碱缺乏，其水平显著降低常见于原发性肉碱缺乏症；而轻度降低则多继发于营养不良、长期素食、反复呕吐、腹泻或其他疾病消耗肉碱所致，如有机酸血症和脂肪酸氧化代谢病等。临床疑似有机酸血症或脂肪酸氧化代谢病时首选串联质谱检测。另外，串联质谱检测羊水酰基肉碱水平可用于判断胎儿是否患有有机酸血症，故有机酸血症的产前诊断可利用串联质谱检测羊水酰基肉碱水平[13]。

1.2.3 类固醇激素谱检测 目前类固醇激素的测定主要采用各种不同的免疫分析方法，但由于各种类固醇激素在体内水平极低，一般检测水平在nmol/L或pmol/L 数量级，上述方法虽能达到一定准确度，但仍存在不同激素间的交叉反应、敏感度和特异度不高[14-15]。串联质谱技术通过检测不同激素间质荷比进行定性，可有效降低假阳性率，提高阳性预测值，广泛用于新生儿先天性肾上腺皮质增生症（congenital adrenal hyperplasia，CAH）的二级筛查[16]。此外，串联质谱技术通过检测不同种类类固醇激素水平，还可筛查除21-羟化酶缺乏症外的其他CAH类型[17]。

1.2.4 同型半胱氨酸检测 同型半胱氨酸（homocysteine,Hcy）通常是利用循环酶法检测,但其高水平的内源性物质对测定结果有较大干扰。高效液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）由于具有高敏感性、特异性及准确性，且能更精确地测定各类同型半胱氨酸水平，近年来已被用于总Hcy的临床检测[18]。

1.2.5 溶酶体酶活性检测 溶酶体酶活性检测主要用于溶酶体贮积病（lysosomal storage disorders,LSDs）临床疑似患者的诊断及新生儿筛查，检测方法包括串联质谱法、荧光法和多免疫定量法。荧光法因每次实验只能检测一种酶活性，多免疫定量法因尚未商品化还难以推广[19-20]。串联质谱技术可根据酶反应产物和内标特征离子对定量，得到产物与内标的信号强度比值，从而计算出酶活性，每次用1个干血斑样本可同时检测6种酶活性，包括酸性β-葡萄糖脑苷脂酶、酸性鞘磷脂酶、β-半乳糖脑苷脂酶、a-L-艾杜糖苷酸酶、a-半乳糖苷酶和酸性a-葡糖苷酶，具有较好的灵敏度和准确度，更适用于开展高通量的新生儿LSDs筛查[21]。

1.2.6 极长链脂肪酸检测 血清极长链脂肪酸（very long chain fatty acids,VLCFAs）定量检测是诊断X-连锁肾上腺脑白质营养不良（X-linkedadrenoleukodystrophy,X-ALD）最主要的生化方法。国内多采用衍生化的质谱方法检测二十二碳脂肪酸(C22:0)、二十四碳脂肪酸(C24:0)、二十六碳脂肪酸(C 26:0)水平以及C 24:0/C 22:0 比值、C 26:0/C 24:0 比值[22]。近年来通过非衍生化的串联质谱技术检测滤纸干血片中极长链酰基肉碱（very long chain acylcarnitine,VLCAC）和溶血磷脂酰胆碱（lysophosphatidylcholine,LPC）可极大缩短每份样本的检测时间，精密度和准确性较好，适合高通量的新生儿筛查。目前，国际上多采用LPC（特别是C26:0-LPC）作为X-ALD的筛查指标[23]。但研究表明C26和C 26/C 22 比值更适合作为我国诊断X-ALD 的生物标志物[11]。

1.3 气相色谱质谱检测

气相色谱质谱技术（gas chromatography-mass spectrometry,GC/MS）是通过检测尿液中有机酸质荷比对其进行定性及定量分析，可为40多种IMD的诊断提供可靠依据，是目前常用的IMD检测方法之一[24]。自1966 年Tanaka 等[25]首次通过GC/MS 检测尿有机酸谱诊断异戊酸血症，GC/MS极大促进了IMD的诊治，成为有机酸血症鉴别诊断的主要方法。卜欣欣等[26]采用GC/MS 技术对2 461 例IMD 患儿尿液中132种代谢物进行检测，发现32种氨基酸、有机酸及脂肪酸氧化代谢病，揭示了此项技术在IMD患儿中各类疾病的疾病谱，证明GC/MS技术对IMD诊断具有特异性。如甲基丙二酸血症和丙酸血症中血丙酰肉碱均增高，仅通过MS/MS 检测难以鉴别，通过GC/MS检测尿有机酸，若甲基丙二酸及甲基枸橼酸等增高提示甲基丙二酸血症，甲基枸橼酸及3-羟基丙酸增高则提示丙酸血症。此外，血MS/MS检测中3-羟基异戊酰肉碱不同程度增高可提示的疾病包括3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症、多种羧化酶缺乏症、β-酮硫解酶缺乏症及3-羟基-3-甲基戊二酸尿症等，但疾病明确诊断则需通过检测尿特异有机酸水平。如尿3-甲基巴豆酰甘氨酸、3-羟基异戊酸伴3-羟基丙酸、甲基枸橼酸等增高提示多种羧化酶缺乏症，不伴3-羟基丙酸及甲基枸橼酸增高提示3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症；尿3-羟-3-甲基戊二酸特异性增高提示3-羟基-3-甲基戊二酸尿症；而大量酮尿提示β-酮硫解酶缺乏症。

1.4 其他检测技术

1.4.1 尿黏多糖电泳检测 尿黏多糖检测是诊断黏多糖贮积症最常用的简便方法。正常情况下，黏多糖可被相应的水解酶降解，故尿中黏多糖检测为阴性。只有当相应酶缺陷或活性下降时，不完全降解的黏多糖在体内贮积，最终从尿中排出，致尿中黏多糖检测阳性[27]。因此，如尿黏多糖阳性，则间接反应黏多糖水解酶缺乏或活性下降。由于不同酶缺陷导致降解产物不同，故可根据尿中黏多糖的不同，进行初步分型及诊断。

1.4.2 尿蝶呤谱检测 尿蝶呤谱分析是四氢生物蝶呤（tetrahydrobiopterin,BH4）缺乏症筛查最重要的检测方法之一。该方法通过检测尿滤纸片中新蝶呤（N）、生物蝶呤（B），并计算B%[B/(B+N)X100%]来鉴别诊断6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶（PTPS）缺乏、BH 4 合成酶尿苷三磷酸环水解酶（GTPCH）缺乏、BH 4 还原酶-红细胞二氢蝶呤还原酶（DHPR）缺乏这三种分型[28]，具有有效且快速的特点。

2 遗传学检测

遗传代谢病多为单基因病，染色体异常引起者少见。遗传学检测主要包括Sanger 测序、基因高通量测序、多重连接依赖探针扩增技术（multiplex ligation dependent probe amplification,MLPA）、定量PCR及染色体芯片检测。

2.1 Sanger测序

Sanger 测序也称一代测序，广泛应用于已知单基因遗传病致病基因或热点致病位点的遗传检测。其优点是可检测点突变、特异性强及快速，缺点是不能检测基因大片段缺失和重复，如肌营养不良和脊肌萎缩症，所以Sanger 测序结果阴性只能排除目标区域的特定突变。

2.2 基因高通量测序

基因高通量测序技术（next generation sequencing,NGS）可同时对几十个基因至全基因进行测序，其优点是高通量、自动化程度高，疾病覆盖广，在临床应用中，对于与多个基因相关疾病的基因诊断更有意义。根据测序区域范围大小，NGS 分为全基因组测序(whole genome sequencing，WGS)、全外显子测序(whole exome sequencing，WES)和靶向捕获测序（Panel），其中WES 是目前IMD 的主要分子诊断手段[29]。如黏多糖贮积症有多种亚型，NGS技术可对其致病基因同时测序，缩短检测时间，降低检测费用。因此NGS 可以快速、精确地检测出常见IMD 的基因突变，为患者提供准确的基因诊断。对于病因不明的疑似遗传病患者优选高通量测序技术检测基因变异，鉴别是否有基因变异导致的疾病。

2.3 MLPA检测

多重连接依赖探针扩增技术（multiplex ligation dependent probe amplification,MLPA）是针对待测核苷酸中靶序列进行的定性和半定量分析技术。该方法灵敏度高、针对性强，主要检测染色体数目非整倍体异常、基因或基因片段的缺失或重复及基因甲基化，临床上多用于检测由于染色体异常或基因大片段缺失所致疾病，如杜氏肌营养不良、地中海贫血、脊髓性肌萎缩症、猫叫综合征（5 p 缺失）、DiGeoge综合征等。虽然该技术具备较多优点，但仍存在不能检测未知点突变及染色体平衡易位等局限性，因此仅对于部分检测不到基因突变的遗传代谢病可进行MLPA检测，以便发现拷贝数异常。由于MLPA检测的疾病数量较少，限制了此技术在临床的开展。

2.4 荧光定量PCR检测

荧光定量PCR 检测（quantitative fluorescence PCR,QF-PCR）是快速靶向分子诊断技术，已广泛用于检测基因拷贝数变异领域，如脊髓性肌萎缩症的诊断[30]，具有快速便捷、成本低廉、普及度高等特点。该方法可通过检测SMN1基因第7外显子的拷贝数判断SMN1基因的缺失情况，从而快速明确是否患病、是否携带致病基因，尤其适用于该病携带者及其产前筛查[31]。定量PCR也常用于基因变异位点检测，如耳聋基因检测，利用定量PCR可以检测数个耳聋基因的几个已知变异位点，取得了较好的效果[32]。

2.5 染色体芯片检测

染色体芯片技术也称染色体微阵列芯片分析（chromosome array analysis,CMA），可以帮助临床医师对儿童发育异常相关的罕见病进行明确诊断，如Prader-willi 综合征、猫叫综合征、22 q 11.2 缺失综合征、Williams-Beuren综合征、Angelman综合征、Russell-silver 综合征等。对于发育落后伴外观畸形或多脏器畸形的患者优选染色体芯片检测。

上述检测技术均是诊断IMD 的重要检测方法，临床医师需要了解各项技术的检测目标、适应疾病及检测周期。在遗传代谢病疑似患者的诊治过程中，依据患者的临床表现，选择合适检测方法，达到即经济又高效的目的，对患者进行精准的诊断或排除遗传代谢病。