长链非编码RNA MHRT、长链非编码RNA H19和NT-proBNP联合指标在老年心力衰竭患者预后中的研究

王燕慧,李梁,陶应敏,谢娟

1. 复旦大学附属上海市第五人民医院全科医学科 2. 复旦大学社区健康研究中心(筹),上海 200240

目前,慢性心力衰竭(chronic heart failure, CHF)已成为各种心血管疾病患者死亡的首要原因[1]。近年来, CHF发病率逐年增加,虽然临床对CHF的诊断和治疗已有较大进展,但死亡率仍很高,患者5年病死率达40%～50%[2]。早期的状态评估有助于采取合理的治疗方法,减少老年心衰患者的死亡率。NT-proBNP是由心室心肌细胞分泌的一类肽类激素,是反映心脏负荷的重要标志物,当机械损伤、心肌受到牵拉和心室前后负荷增大时可释放,可评价心衰的严重程度和患者的预后[3]。但由于高龄、肾功能不全、肺栓塞等因素会引起NT-proBNP假性升高,因此其特异度不高[4]。

多项研究表明, CHF与自噬、炎症反应、信号转导、微小RNA(miRNA)、长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)等相关[5-6]。LncRNA动态表达于不同细胞类型、发育阶段或疾病状态,它影响了某些疾病的发病机制及发展过程,如心血管疾病和肿瘤等[7]。MHRT是一种通过可变剪切产生的lncRNA分子,通过Brg1抑制心肌肥厚的发生,起到保护心脏作用的肌球蛋白重链相关RNA转录物,为肌球蛋白重链7的编码基因[8]。且MHRT已被证明与CHF患者的生存和预后相关[9-10]。H19是一种母源性印记基因,长度为3.0 kb,转录本为lncRNA,进化保守性很强,在胚胎发育期表达得很丰富。Greco等[11]2016年证实,在非终末期心力衰竭患者、终末期心力衰竭患者和心肌肥厚小鼠模型中, H19都可以看到明显的增长。该研究表明,这些指标在预测老年心力衰竭患者预后方面具有重要作用。

1 资料和方法

1.1一般资料选取2020年6月—2021年6月上海市第五人民医院收治的CHF患者161例进行研究,其中男性82例,女性79例,年龄65～91岁,平均(76.4±7.2)岁。纳入标准： (1)患者符合中国心力衰竭指南中的诊断标准[12],患者出现心力衰竭症状及体征;左心室射血分数(left ventricular ejection fraction, LVEF)降低或正常;NT-proBNP>125 ng/L; (2)美国纽约心脏病学会(NYHA)心功能Ⅱ～Ⅳ级; (3)年龄≥65岁; (4)随访时间18个月。排除标准： (1)近3月出现心梗、脑血管疾病及不稳定心绞痛者; (2)患有感染或炎性疾病、凝血功能不全、正进行免疫治疗及自身免疫系统疾病的患者; (3)恶性肿瘤者、脏器功能不全的重症患者; (4)患者因某种原因无法完成相关检测工作,中断复诊。这项研究由上海市第五人民医院医学伦理委员会审查通过,已征得所有患者知情同意并签字。

1.2主要试剂与仪器RNA提取试剂：TRIeasyTMLS Total RNA Extraction Reagent, yeasen公司,货号19201ES60;逆转录试剂盒： PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time), TAKARA公司,货号RR047Q;定量PCR试剂TB Green© Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus), TAKARA公司,货号RR420Q。Q-PCR仪器：ABI公司,仪器型号Vii7。

1.3研究方法人口学资料、疾病史、临床、化验及超声心动图检查结果,于入院24 h内采集入组患者。采集心衰患者入院第2天晨起空腹静脉血,经1 500 r/min, 4 ℃离心10 min后收集血清,-80 ℃保存待测。用双抗体夹心ABC-ELISA法检测血清NT-proBNP水平,为美国R&D公司生产。采用试剂盒提取血清总RNA并反转录得cDNA,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)仪扩增MHRT、 H19及其内参(U6),引物序列见表1,引物由尚亚生物公司合成。采用 2-△△CT法计算血清MHRT、 H19相对表达量。采用超声心动图获取心功能指标(LVEDD、左室收缩末期内径(LVESD)及LVEF。对所有心衰住院患者实施了规范药物治疗,并进行18个月的随访,在此期间没有进行其他干预。该不良事件被定义为在18个月内因心力衰竭再次入院治疗或出现心源性死亡。出院后每3个月进行一次随访,通过查看病史资料、门诊复查和电话回访等方式,判断是否出现不良事件。根据CHF患者是否出现主要终点事件分为不良心血管事件[MACEs(+)]组和MACEs(-)组。

表1 qRT-PCR引物序列

2 结果

2.1MACEs(+)组和MACEs(-)组的临床特征比较随访过程中有90例发生了主要终点事件,其中心源性死亡(28例),心衰再入院(62例);未发生主要终点事件者50例;失访21例。MACEs(+)组的患者年龄、总胆固醇高于MACEs(-)组(P<0.05), eGFR低于MACEs(-)(P<0.05)。在性别、体质量指数(BMI)、心率、肝功能、糖化血红蛋白方面2组差异无统计学意义。MACEs(+)组血清H19、 NT-proBNP、 LVEDD高于MACEs(-)组, MHRT、 LVEF低于MACEs(-)组,差异均有统计学意义。见表2。

2.2不同LVEF患者血清标志物浓度比较随着LVEF降低,心功能严重程度的加重,心衰患者H19、 NT-proBNP水平升高, MHRT水平降低,差异均有统计学意义。见表3。

2.3血清标志物与心功能指标的相关性NT-proBNP和H19均与LVEF呈负相关(P<0.001),而MHRT则与LVEF呈正相关(P<0.001),由此可见,随着NT-proBNP和H19水平的升高以及MHRT水平的降低,心衰患者LVEF值逐渐降低,心功能严重程度逐渐加重。见表4。

表2 是否发生MACEs的人群基线特征

2.4心力衰竭预后危险因素分析将NT-proBNP以300 ng/L为界、 MHRT以0.85为界、 H19以0.94为界分为2组,并均以分类变量的形式进入Cox回归分析模型中。单因素Cox回归分析显示低MHRT、高NT-proBNP和高H19是发生MACEs、心衰再入院的主要危险因素(P<0.05)。多因素Cox回归分析显示低MHRT、高NT-proBNP和高H19与发生MACEs、心衰再入院均有关(P<0.05)。见表5。

根据危险因素MHRT<0.85、 H19>0.94和NT-proBNP>300 ng/L出现的个数进行分组,利用Kaplan-Meier曲线对不同组别的患者生存率进行比较。在心力衰竭的老年患者中,随着危险因素的增加,患者的生存时间下降。见图1。

图1 不同组别患者生存情况的K-M曲线

表3 不同LVEF水平心衰患者血清标记物水平比较

表4 血清标记物与心功能指标的相关性

表5 Cox回归分析老年心衰患者不良终点事件的危险比

2.5血清标志物对心衰预后的预测价值比较血清NT-proBNP、 MHRT及H19预测心衰预后的临界值、灵敏度、特异度及曲线下面积见表6。NT-proBNP、 MHRT、 H19单独预测的AUC分别为0.702、 0.716和0.755。MHRT联合H19预测心衰预后的AUC为0.791,优于NT-proBNP联合MHRT、 NT-proBNP联合H19。3个指标联合预测的AUC为0.832,效果最优。见图2。

3 讨论

在美国,超过九分之一患者的死亡是由心力衰竭引起的,大量CHF患者在确诊后5年内死亡[13]。年龄愈高,心衰患者的预后愈差[14]。对心衰患者的预后做出准确的评估,能及时干预疾病的进程,选择最佳的治疗方案,减少患者的病死率,提高患者的生存质量。

LncRNA参与多种重要生理过程,如细胞分化、发育、防御反应和免疫反应等,为长度大于200个核苷酸的RNA分子[15]。LncRNA对组织、细胞类型的表达特异性比蛋白质编码基因更强[16]。有研究发现, MHRT通过miR-3185促进心肌梗死后心肌纤维化[17]。Lie Zhang等[10]发现,CHF患者比健康人群血浆中MHRT表达降低,随访研究发现MHRT表达水平较低的CHF患者生存条件较MHRT表达水平较高的患者更差。另有研究发现, CHF患者血浆中MHRT的表达水平异常升高, CHF的发病风险和预后与MHRT基因rs7140721、 rs3729829、 rs3729825 SNP位点存在显著相关性[9]。这些研究表明,心力衰竭患者对MHRT的表达在不同的研究中存在争议。在本研究中, MACEs(+)组血清MHRT低于MACEs(-)组,多因素Cox回归分析显示低MHRT与发生MACEs、心衰再入院均有关。MHRT预测不良事件的AUC为0.716。

表6 血清标记物对心衰患者预后的预测价值

图2 血清MHRT、 H19、 NT-proBNP单独(A)及联合(B)预测心衰患者发生MACE的ROC曲线

这与Lie Zhang等[10]的研究结果一致, CHF患者MHRT表达下调,且MHRT的特异性表达具有预后价值。

H19位于人类第11号染色体上,是心肌细胞凋亡和增殖的重要调节因子[18]。H19在小鼠衰竭心脏中被发现下调,并在猪和人的心脏中被验证[19]。H19是心肌细胞中促衰老lncRNA,通过靶向miR-19a/ socs1/p53轴驱动心肌细胞衰老[20]。Liu等[21]证实H19高表达于肥厚心肌和心力衰竭中,在抑制心肌细胞肥大过程中, H19-miR-675轴起到重大作用。本研究证实,随着H19水平的升高,心衰患者LVEF值逐渐降低,心功能严重程度逐渐加重。多因素Cox回归分析显示高H19是发生MACEs、心衰再入院的主要危险因素。H19单独预测心衰患者预后的AUC为0.755,较MHRT、 NT-proBNP有更高的预测能力。另外,本研究显示MHRT联合H19预测心衰预后的效果优于NT-proBNP联合MHRT、 NT-proBNP联合H19。三者联合预测效果最优。

NT-proBNP水平与LVEF负相关,与LVEDD正相关,表明NT-proBNP与心脏的结构、功能存在某种关联,且MACEs(+)组的NT-proBNP高于MACEs(-)组,这与本研究之前的研究结果一致[22]。NT-proBNP单独预测心衰患者预后的效果较差,多因子联合检测比NT-proBNP单独检测具有更高的价值,可提高预测效能。

该研究仅限于单个中心的小样本研究,所以有一定的局限性, LncRNA未分层,随访时间不长,出院后指标也未进一步随访,评估心衰预后有局限性。这项研究结果表明,通过联合检测不同的反映心衰指标,有助于提高心衰患者发生主要终点事件的预测能力,仍将是未来的主要研究方向[22]。