社会隔离对老年小鼠血清细胞因子和肝脏基因表达的影响

肖振明,杨浩,潘苗苗,王同尧,钱程朗,赵超,2

1. 复旦大学基础医学院医学分子病毒学教育部卫健委重点实验室,上海 200032; 2. 国家老年疾病临床医学研究中心(复旦大学附属华山医院),上海 200040

由于缺乏儿女陪伴,我国空巢老人更易缺乏与外界沟通交流,社会网络缩小,社会隔离应激(social isolation stress, SIS)水平显著提升[1]。相关研究表明,社会隔离与抑郁[2]、虚弱[3]、心血管风险[4]乃至死亡率[5]有关,但社会隔离对老年肝脏健康的影响还缺乏研究。据报道,心理社会应激可通过过度激活下丘脑-垂体-肾上腺(Hypothalamic pituitary adrenal, HPA)轴并直接诱导促炎细胞因子,如白细胞介素-1(Interleukin-1, IL-1)、白细胞介素-6(Interleukin-6, IL-6)和肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α, TNF-α)等释放而促进肝脏炎症[6]。因此,本研究通过老年小鼠的社会隔离模型观察社会隔离对老年小鼠身体健康的影响,通过检测该动物模型中血清炎症相关细胞因子水平变化和肝脏差异表达基因,为社会隔离对老年肝脏健康的影响提供分子机制水平的理论依据,为提高老年人生活质量、促进健康老龄化提供参考。

1 材料与方法

1.1实验动物老年小鼠： SPF级雌性C57BL6小鼠10只, 30月龄,体质量(35.2±2.4)g;年轻小鼠： SPF级雌性C57BL6小鼠5只, 8周龄,体质量(22.2±0.7)g。

实验动物购自北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK(京)2021-0011],饲养于复旦大学实验动物楼[SYXK(沪)2020-0032]。

所有动物实验均经过复旦大学基础医学院实验动物伦理委员会批准(批准号：20220627-001),按照实验动物处理指南给予动物福利并进行相关处理。

1.2主要试剂与仪器小鼠IL-1βELISA(酶联免疫吸附测定)试剂盒(EK101B-96),小鼠TNF-αELISA试剂盒(EK282/4-96),小鼠IFN-γ高敏 ELISA试剂盒(EK280HS-96),小鼠IL-6 ELISA试剂盒(EK206/3-96),小鼠IL-10 ELISA试剂盒(EK210/4-96),购自上海联科生物有限公司。微量移液器(美国Eppendrof公司);Synergy H1MF酶标仪,购自美国BioTek公司。

1.3动物实验分组小鼠予全价营养饲料,恒温恒湿适应性饲养1周后,采用数字表法将老年小鼠随机分为2组：隔离组(n=5),隔离组老年小鼠在32 cm×18 cm×15 cm的不透明笼内单笼隔离饲养;同笼组(n=5),同笼组老年小鼠与年轻小鼠以1∶1的比例,每笼两只在32 cm×18 cm×15 cm的笼中饲养。饲养及实验期间2组动物均自由进食饮水,并检测其体重变化,每周记录1次。4周后检测老年小鼠的血清炎症因子水平和肝脏基因转录。

1.4酶联免疫吸附试验麻醉小鼠后眼眶采血, 4 ℃静置过夜后低温离心,吸取上层血清分别用对应的酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素10(IL-10)和干扰素-γ(IFN-γ)水平。

1.5RNAseq法检测小鼠肝脏差异表达基因解剖取老年小鼠肝脏并称重记录,冻存供指标检测。Trizol方法提取老年小鼠肝脏总RNA。Qubit(美国Thermo公司)精确定量RNA总量(≥500 ng),取1μL总RNA通过qubit仪器定量。利用琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性(28S：18S≥1.5),根据浓度取300 ng用1%琼脂糖电泳检测。

利用DESeq软件对不同样本组之间筛选差异表达的已知基因,采用每百万测序片段(fragments)中来自某一基因每千碱基长度的测序片段数目(FPKM)来进行基因表达水平定量。

对筛选出的差异表达基因进行KEGG信号通路富集分析(http：//www.kegg.jp/),针对隔离组小鼠显著上调表达的基因,采用TopGO软件进行基因本体论(Gene ontology, GO)功能分析,将所有差异表达基因与GO、 KEGG数据库对比,利用Fisher精确检验计算GO和Pathway在差异表达基因中是否有显著富集(P<0.05)。

2 结果

2.1一般情况比较实验前,老年小鼠背部可见明显灰色杂毛、毛发光泽度减弱,反应迟钝不喜动,对外界反应淡漠;同笼干预结束后,相比隔离组小鼠,同笼组老年小鼠活动增多,背部毛发亮度增加;眼眶采血后,隔离组小鼠死亡2只,同笼组小鼠未见死亡。

2.2小鼠体质量及肝脏系数比较隔离老年小鼠与同笼老年小鼠干预前后体重、肝脏质量、肝脏系数差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.3社会隔离对小鼠血清细胞因子的影响血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素10(IL-10)和干扰素-γ(IFN-γ)使用酶联免疫吸附剂分析试剂盒进行测定,结果显示,与同笼组相比,隔离组老年小鼠血清的TNF-α、 IL-1β和IL-6水平均升高。见表2。

2.4隔离小鼠与同笼小鼠肝脏的差异基因分析与同笼老年小鼠相比, 隔离老年小鼠肝脏中检测到543个显著差异的基因, 其中289个基因上调(log2 FoldChange≥1,P≤0.05), 254个基因下调(log2 FoldChange≤1,P≤0.05)。见图1。

表1 隔离组和同笼组老年小鼠体质量及肝脏系数

表2 隔离组和同笼组老年小鼠血清细胞因子结果

注：深点代表显着上调基因,浅点代表显着下调基因;横坐标显示不同样品中基因的表达倍数变化;纵坐标显示基因表达差异的显着性水平。图1 隔离组和同笼组老年小鼠肝脏差异基因火山图

对差异基因进行KEGG信号通路富集分析, 显著富集的两条通路为趋化因子信号通路 (Chemokine signaling pathway,P<0.01)和细胞因子受体相互作用(Cytokine-cytokine receptor interaction,P<0.05), 两条通路均富集的基因有趋化因子(CXC基序)配体1(C-X-C ligand 1, CXCL1), Cxcl5, Cxcl13和前血小板碱性蛋白(Pro-platelet basic protein, Ppbp)编码基因以及预测基因13306(predicted gene 13306, Gm13306)。这5个免疫相关基因在隔离组老年小鼠中均显著上调, 这些差异表达基因在社会隔离对肝脏影响中的明确机制尚待后续深入探索。信号通路富集情况见表3。

GO功能分析中,在隔离组老年小鼠中显著上调的生物过程(Biological process)、分子功能(Molecular function)和细胞组分(Cellular component)分别有427、 102和15个条目,其中生物过程主要涉及免疫反应(Immune response);细胞组分主要涉及循环免疫球蛋白复合物(Immunoglobulin complex, circulating);分子功能主要涉及CXCR趋化因子受体结合(CXCR chemokine receptor binding)、免疫球蛋白受体结合(Immunoglobulin receptor binding)、趋化因子活性(Chemokine activity)等(见图2)。从差异表达基因GO富集分析结果中,选取最显著的20个条目绘制散点图,显著富集的GO包括CXCR趋化因子受体结合(CXCR chemokine receptor binding)、嗜中性粒细胞趋化性的正调控(Positive regulation of neutrophil chemotaxis)、粒细胞趋化性的正调控(Positive regulation of granulocyte chemotaxis)等(见图3)。

表3 隔离组和同笼组老年小鼠肝脏差异基因KEGG显著富集通路

注： 横坐标代表-log10(Pvalue),纵坐标代表显著富集的GO名称。图2 隔离组老年小鼠显著上调的GO功能分类

注： 横坐标代表Rich factor,表示富集程度;纵坐标代表显著富集的GO名称。图3 隔离组老年小鼠显著上调的GO条目气泡图

3 讨论

当今社会人们的传统家庭意识逐步淡化,老年人可能会面临更大的社会隔离风险[7]。社会隔离对老年人生理、心理和社会健康等方面都存在不同程度的危害,合理应用老龄动物研究社会隔离对身体健康影响的生物学机制,为进一步研究老年社交环境与身心健康之间的关系提供科学依据,对促进实现健康老龄化有积极意义。本研究利用老龄C57BL/6J小鼠进行隔离饲养模型的研究,结果显示社会隔离造成老年小鼠外周血炎性细胞因子TNF-α、 IL-1β和IL-6水平升高,以及肝脏趋化因子编码基因表达水平升高。

炎症可能在老年社会隔离中起到关键病理作用。一方面,衰老本身与促炎状态有关,衰老细胞通过破坏外周免疫系统激活慢性炎症状态,导致机体过度的先天免疫活性,释放促炎细胞因子并减少抑炎因子表达[8];另一方面,社会隔离引起的心理社会应激通过过度激活下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴,导致分泌肾上腺素、去甲肾上腺素、皮质醇等应激激素,促进白细胞的迁移和活化并诱导促炎细胞因子,如IL-1β、 IL-6和TNF-α等分泌增加,从而加重炎症反应[9]。本研究运用酶联免疫吸附试验探索了社会隔离对老年小鼠血清细胞因子水平的影响,结果显示隔离组老年小鼠外周血IL-1β、 IL-6和TNF-α水平显著增加,提示社会隔离可能激活老年小鼠的慢性炎症状态,增加炎症相关疾病风险。值得注意的是, IL-1β、 IL-6和TNF-α不仅提示更高的炎症风险,还与更高的应激水平有关,有研究指出外周IL-1β、 IL-6和TNF-α的升高可作为老年精神应激、抑郁症、全因性痴呆易感性的潜在生物标志物[10]。

趋化因子越来越被认为是肝脏炎症的重要介质,在患有肝脏炎性疾病(包括由酒精、药物(对乙酰氨基酚)和病毒(丙型肝炎)诱导的疾病)的患者中,肝脏内的趋化因子表达增加,并且与这些肝脏疾病中的炎性细胞募集直接相关。本研究运用RNAseq方法从mRNA水平探索了社会隔离老年小鼠肝脏的差异表达基因和通路, KEGG富集分析结果显示社会隔离对肝脏的影响可能主要集中于趋化因子信号通路和细胞因子受体相互作用的异常, 两条通路均富集的基因有Cxcl1, Cxcl5, Cxcl13, Ppbp和Gm13306。Cxcl1, Cxcl5, Cxcl13, Ppbp是参与将嗜中性粒细胞募集到炎症部位的趋化因子,其转录水平受到TNF-α, IL-1β和IL-6的调控诱导[11-12],该过程对于清除病原体和受损组织很重要,但如果失调也可能导致组织损伤和慢性炎症。此外, Gm13306作为一种非编码RNA基因,在免疫反应中的确切作用尚不清楚,但很可能在调节炎症相关基因表达中发挥作用,已有报道其在自发性炎症中上调[13]。与之一致的是,本研究的GO富集结果也显示在隔离组老年小鼠肝脏的趋化因子上调表达,提示免疫细胞趋化性上升。

总之,本研究初步得出社会隔离这种干预社交环境的实验处理可能会通过激活炎症影响老年小鼠肝脏健康。除了应激-慢性炎症机制外, 社会隔离还可能通过其他生物学机制影响肝脏健康,例如通过激活血管痉挛机制减少肝脏灌注、减少自主运动导致脂肪肝、增加酒精和药物滥用的风险加重肝脏代谢负担等,此外, DNA水平变异、蛋白功能、药物代谢能力、肠道菌群改变、机体其他重要器官功能改变等也均可在后续研究中运用相应的组学手段进行深入探索,从而更全面认识社会隔离状态对老年健康的影响。