CXCR3及其配体对脊柱结核的诊断价值

李汶谕

(鹤壁煤业(集团)有限责任公司总医院骨科,河南鹤壁 458030)

结核分枝杆菌主要通过呼吸道传播,感染后可通过血液到达骨骼和消化系统等身体多个系统,脊柱结核(spinal tuberculosis,ST)是常见的肺外结核类型,约占肺外结核发病率的50%[1]。临床上ST的诊断比肺结核更具有挑战性,穿刺病理检查和成像虽然可辅助诊断ST,但病理检查属有创检查,而包括磁共振在内的影像检查的特异性较低[2]。因此,探讨辅助诊断ST的生物标记物对ST的诊断、治疗监测和预后评估具有重要作用。辅助性T细胞1型(helper T cell type 1,Th1)细胞介导的免疫在结核病耐药中发挥主导作用,CXC趋化因子受体3(CXC chemokine receptor 3,CXCR3)系统在Th1细胞介导的免疫中发挥重要作用。CXCR3配体包括三种趋化因子:趋化因子CXC配体9(chemokine CXC ligand 9,CXCL9),由IFN-c诱导的单因子;趋化因子CXC配体10(chemokine CXC ligand 10,CXCL10),由IFN-c诱导的10kDa蛋白;CXCL11,IFN诱导的T细胞趋化剂[3]。这些趋化因子诱导CD4效应T细胞运输到感染部位。CXCL10作为结核病的生物标志物已经得到相关研究证实[4],但CXCL9、CXCL10对ST的诊断价值较少见报道。本研究观察了ST和非ST患者血清CXCR3配体水平及CXCR3配体对ST的诊断价值,现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

经医院伦理委员会批准,选择2019年1月～2021年6月在本院就诊的53例ST患者作为研究组。纳入标准:具有典型结核感染症状,且出现脊髓压迫症状,经病理学确诊为ST;年龄18～65岁;患者对研究知情并签署知情同意书。排除患有其他免疫疾病、肿瘤疾病、HIV感染或代谢紊乱者。按年龄“±2岁”、性别相同、1∶1匹配的原则,抽取同期在本院接受健康体检的53例受试者作为对照组。对照组患者没有任何活动性结核史或近期与任何活动性结核患者密切接触史。两组受试者的一般资料差异无统计学意义(P>0.05),见表1。

表1 两组受试者一般资料比较

1.2 研究方法

所有受试者均于清晨空腹抽取外周静脉血10 mL,分2管存放,每管5 mL。用于酶联免疫吸附法检测的静脉血置室温放置2 h,以3000 r/min的速度离心15 min,分离血清在-80 ℃进行储存;检测前从冰箱中取出待测样品,室温下放置60 min,采用ELISA法检测CXCR3及CXCL9、CXCL10、IFN-γ水平,严格按照操作说明书操作,试剂购自赛默飞世尔。另取5 mL静脉血行红细胞溶解,使用TRIzol试剂从白细胞中提取总RNA,根据反转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagent kit(赛默飞世尔公司)操作说明通过反转录合成cDNA。RT-qPCR反应体系:2 μL cDNA、1 μL正向引物,1 μL反向引物,12.5 μL的TB Green Premix Ex Taq和8.5 μL的DEPC。PCR反应参数:预变性95 ℃30 s,1个循环;PCR95 ℃5 s,60 ℃30 s,40个循环;采用GAPDH作为内参,采用比较循环抑制法(2-ΔΔq)计算相对表达量。引物序列:GAPDH:正向5’-CATCCACTGGTGCTGCCAAGGCTGT-3’,反向5’-ACAACCTGGTCCTCAGTGTAGCCCA-3’;CXCR3:正向5’-ATGCGAGAGAAGCAGCCTTT-3’,反向:5’-TCCTATAACTGTCCCCGCCA-3’;CXCL9:正向5’-GAAGCAGCCAAGTCGGTTAGTG-3’,反向5’-AATCATCAGCAGTGTGAGCAGTG-3’;CXCL10:正向5’-TGGCATTCAAGGAGTACCTC-3’,反向5’-TTGTAGCAATGATCTCAACACG-3’;IFN-γ:正向5’-CTAATTATTCGGTAACTGACTTGA-3’,反向5’-ACAGTTCAGCCATCACTTGGA-3’。

1.3 统计学方法

采用SPSS 23.0软件进行统计学分析,计量资料采用独立样本t检验(正态分布资料)或非参数检验(非正态分布资料);计数资料采用卡方检验,采用ROC曲线计算不同指标诊断ST的灵敏度、特异性、最佳截断值(cut-off)、曲线下面积(area under curve,AUC)和95%CI,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

研究组患者的血清CXCL3、CXCL9、CXCL10和IFN-γ水平及其mRNA表达水平均显著高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05),见表2-3。

表2 两组受试者血清IFN-γ、CXCL3及配体表达水平相比较(pg/mL)

血清IFN、CXCL3、CXCL9、IFN-γ诊断ST的灵敏度分别为88.7%、84.9%、88.7%、81.1%,特异性分别为88.7%、96.2%、94.3%、94.3%,AUC分别为0.933、0.915、0.961、0.918。见表4和图1。

图1 血清IFN-γ、CXCL3及配体诊断ST的ROC曲线

表4 血清IFN-γ、CXCL3及配体诊断ST的临床价值

外周血IFN、CXCL3、CXCL9和IFN-γ的mRNA水平诊断ST的灵敏度分别为81.1%、81.1%、86.8%和84.9%,特异性分别为73.6%、96.2%、98.1%和88.7%,AUC分别为0.829、0.926、0.921和0.935。见表5和图2。

表3 两组受试者外周血中IFN-γ、CXCL3和配体mRNA表达水平比较

表5 外周血中IFN-γ、CXCL3和配体mRNA表达水平诊断ST的临床价值

图2 外周血中IFN-γ、CXCL3和配体mRNA水平诊断ST的ROC曲线

3 讨论

ST是最常见的骨关节结核,其病因是结核分枝杆菌入侵宿主,繁殖并通过血液和淋巴管传播到椎体边缘,导致椎体或椎间盘破坏、脊柱畸形、功能障碍、截瘫甚至死亡[5]。结核分枝杆菌感染的免疫反应主要是细胞介导的免疫反应,在此期间,特异性Th1细胞被结核分枝杆菌抗原致敏,产生IFN-γ。IFN-γ是细胞抵抗结核分枝杆菌感染的重要因子,可诱导趋化因子发挥作用,导致巨噬细胞激活,从而发挥抗结核分枝杆菌的免疫作用[6]。

趋化因子受体主要表达于骨髓中的各种白细胞、上皮细胞和血管内皮细胞等,可调节白细胞在组织中的转运和细胞归巢,在免疫细胞和免疫器官的发育、免疫反应、炎症反应和病原体感染中发挥生理和病理作用[7]。CXCR3主要表达于活化的T淋巴细胞(特别是Th1细胞)、B淋巴细胞、自然杀伤细胞等表面,是活化T细胞中重要的趋化因子受体,受到刺激时,在T细胞表面迅速上调并高度表达[8]。既往研究显示,ST患者病灶区的CXCR3阳性表达面积高于对照组[9]。ST患者感染结核分枝杆菌后,T细胞能够识别结核分枝杆菌并与其对抗,同时分泌IFN-γ,IFN-γ进一步诱导CXCR3配体产生,促进CXCR3和CXCR3配体在Th1细胞的结合,招募更多的Th1细胞进入炎症部位以发挥炎症作用。

CXCL9是趋化因子CXC亚族的一员,体内神经胶质细胞和巨噬细胞受到IFN-γ刺激产生CXCL9,其受体是CXCR3,在炎症反应中发挥重要作用。CXCL9的趋化性主要由CXCR3介导,CXCL9和CXCR3结合后,CXCR3被激活,刺激Src磷酸化和Src激酶活性,并增加磷脂酰肌醇3激酶和AKT活性,参与炎症反应的病理过程[10]。ST组中CXCR3和CXCL9表达增加,可能加强CXCR3和CXCL9结合,激活下游通路,增强结核分枝杆菌感染期间的炎症反应[11]。CXCL10是CXC非ELR亚家族中的趋化因子之一,受IFN-γ刺激的细胞可直接分泌CXCL10,CXCL10选择性激活T细胞中IFN-γ基因的表达,正反馈可招募更多T细胞,参与细胞生长、分化、凋亡和炎症[12]。本研究中,ST组IFN-γ和CXCL10表达增加,与CXCL9的表达趋势一致,这些结果提示CXCR3及其配体表达在ST中具有临床意义。

既往一项研究显示,CXCR3及其配体在肺结核的诊断中具有临床意义[13]。本研究结果进一步提示了CXCR3及其配体在ST中的作用。本研究显示,血清CXCR3、CXCL9、CXCL10、IFN-γ水平诊断ST的AUC均高于0.9,外周血CXCR3及其配体mRNA诊断ST的AUC均>0.8。理想的ROC曲线下面积为1,诊断性试验中AUC在0.7～0.9之间的诊断价值中等,0.9以上时诊断价值高。本研究结果说明,血清CXCR3及其配体、外周血CXCR3及其配体mRNA诊断ST的临床价值较高,外周血RT-qPCR获得的CXCR3及其配体mRNA诊断价值不高于血清ELISA法结果,结果提示,ST患者可首选血清CXCR3及其配体而非RT-qPCR检测进行诊断。

综上所述,本研究显示,ST患者的CXCR3、CXCL9、CXCL10和IFN-γ高表达,血清CXCR3、CXCL9、CXCL10和IFN-γ水平可能是辅助诊断ST的有效方式。本研究的局限性在于:样本量较少,且来自单中心;未来需要收集更多病例进行多中心研究,进一步论证研究结论。