长链非编码核糖核酸FRAPT在三阴性乳腺癌中的表达及其生物学意义

何赛，刘志芳，李瑞玮

1.云南省第三人民医院甲状腺乳腺外科，云南 昆明 650011；2.云南大学生命科学学院，云南 昆明 650011；3.云南省第三人民医院医学检验科，云南 昆明 650011

乳腺癌是一类异质性肿瘤，根据基因表达谱，通常可将其分为5 种亚型：Luminal A 型、Luminal B 型、人表皮生长因子受体-2（human epidermal growth factor receptor-2，Her-2）阳性型、正常细胞样型（normal-like）和基底型乳腺癌（basal-like breast cancer，BLBC）［1］。三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是指癌组织免疫组织化学法检测雌激素受体（estrogen receptor alpha，ERα）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）和Her-2 均为阴性的乳腺癌（占15% ～20%），相对于基因表达谱的检测方法，免疫组织化学法的分型检测更省时简便，因此TNBC的概念在临床上使用广泛［2］。TNBC 是乳腺癌治疗的难点及研究热点，TNBC 确诊后，存活期超过5 年的患者仅26.9%［3-4］。因此，研究TNBC新的治疗方法具有重要意义。

近年来的大量研究表明，长链非编码核糖核酸（lncRNA）在生命活动中具有重要调节功能，并发挥重要作用。lncRNA 表达失调可导致多种疾病发生，特别是在肿瘤的发生发展过程中，lncRNA 起着非常关键的作用［5-6］。从调控水平上来说，lncRNA 可在表观水平、转录水平、转录后水平对基因的表达发挥重要作用［7］。研究表明，lncRNA NKILA 可与炎癌转化中的关键信号通路NF-κB 相互作用，通过结合NFκB／IκB 抑制IkB 激酶（IκB kinase，IKK）诱导的IκB磷酸化，从而抑制乳腺癌细胞的增殖及转移［8］。也有研究发现，lncRNA TROJAN通过泛素化促进ZMYND8降解，从而促进TNBC 的增殖及转移，其在TNBC 细胞中高表达且与不良预后相关［9］。lncRNA 参与乳腺癌的耐药调控也有报道，如lncRNA GAS5、HOTAIR与乳腺癌他莫昔芬耐药密切相关［10-13］。因此，研究lncRNA 为解析乳腺癌的发生发展机制提供了新视角，并具有重要意义。目前尚未见有关lncRNA FRAPT的报道，因此，本研究在TNBC 细胞中表达了lncRNA FRAPT，并分析其对TNBC 细胞增殖、细胞周期及耐药的影响，为TNBC的治疗提供新的策略。

1 材料与方法

1.1 细胞及siRNA 人TNBC细胞系（MDA-MB-231、HCC1806）购自中国科学院昆明动物研究所细胞库，分别用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640、F12 培养基，于37 ℃，5%CO2恒温细胞培养箱中培养，当细胞密度达到80%后，进行传代培养；lncRNA FRAPT 的siRNA（si-lncRNA FRAPT-1#、si-lncRNA FRAPT-2#）、siRNA 阴性对照（si-Ctrl）由广州锐博生物技术有限公司合成。

1.2 主要试剂 LipofectamineTM2000 试剂盒、细胞周期检测试剂盒、RPMI1640、F12培养基购自深圳硕擎生物技术有限公司；化疗药物紫杉醇（paclitaxel，PTX）购自美国辉瑞公司。

1.3 细胞转染 按照LipofectamineTM2000 试剂盒说明书进行操作，将si-lncRNA FRAPT-1#、si-lncRNA FRAPT-2#和si-Ctrl（阴性对照）分别与40 nmol／L寡核苷酸和LipofectamineTM2000 试剂混合后，转染MDAMB-231、HCC1806细胞，48 h 后，收集细胞。

1.4 生物信息学及数据库分析 利用scRNASeqDB及TCGA 在线生物信息学分析数据库，分析lncRNA FRAPT在TNBC中的表达情况及其与预后的相关性。

1.5 沉默lncRNA FRAPT 对细胞增殖能力影响的检测 采用磺酰罗丹明B（Sulforhodamine B，SRB）试验。收集处于对数生长期MDA-MB-231、HCC1806细胞，以1×104个／孔接种96 孔板，分别加入RPMI1640和F12 培养基，100 μL／孔，置37 ℃，5% CO2细胞培养箱培养，分别在0、24、48、72 h后加入10%TCA溶液，200 μL／孔，固定24 h；弃固定液，1×PBS洗涤1次，加入SRB 溶液，室温摇床10 min；加入Tris-HCl 溶解，200 μL／孔，用酶标仪于530 nm 波长处检测A值。

1.6 沉默lncRNA FRAPT 对细胞周期影响的检测采用流式细胞术，按细胞周期检测试剂盒说明书进行操作。将MDA-MB-231 细胞培养48 h 后，收集细胞，加入75%酒精，4 ℃固定过夜；重新悬浮在0.6%NP-40溶液中，每1×106个细胞中加入1 μL 10 mg／mL PI及1μL 100mg／mL RNaseA（PI终浓度为0.1mg／mL，RNaseA 终浓度为1 mg／mL），避光染色30 min；上流式细胞仪检测。

1.7 沉默lncRNA FRAPT对细胞耐药性影响的检测收集对数生长期的MDA-MB-231、HCC1806 细胞，以2×104个／孔接种96 孔板，每孔分别加入RPMI1640和F12 培养基，100 μL／孔，置37 ℃，5% CO2细胞培养箱，加入PTX处理细胞，20 μmoL／（L·孔），分别在培养0、24、48、72 h后加入10%TCA溶液，200 μL／孔，固定24 h，其他步骤同1.5项。

1.8 统计学分析 采用SPSS 20.0 软件进行统计学分析，实验数据用均值±标准差（x±s）表示，所有试验均重复3 次。两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 lncRNA FRAPT 在TNBC 中的表达及预后分析 分析发现，TNBC中有许多差异化表达的lncRNA，见图1。选取10个在芯片检测结果中差异表达前10的候选基因进行后续分析，见表1。ENCORI 网站工具（http：／／starbase.sysu.edu.cn／index.php）预后相关性分析显示，这些高表达于TNBC 的lncRNA 中，lncRNA FRAPT 高表达与患者较差的预后呈正相关，研究对象的生存时间从随机化时开始计算，因此最开始时两组研究对象的生存率均为100%（生命值均为100%）。随着治疗时间的延长，两组研究对象的生存率持续下降，但lncRNA FRAPT 高表达组（绿线）下降速度较快，即Hazard大于低表达组（棕线），绿线一直处于棕线上方，差异有统计学意义（Hazard Ratio=1.66，P=0.047）。见图2。表明lncRNA FRAPT可能在TNBC 中发挥重要功能。因此，选择lncRNA FRAPT用于后续功能研究。

图1 TNBC 和癌旁组织基因差异化表达分析热图（A）及火山图（B）Fig.1 Heat map（A）and volcanic map（B）of differential expression gene analysis of TNBC and adjacent tissues

图2 lncRNA FRAPT临床预后相关性分析Fig.2 Correlation analysis of clinical prognosis of lncRNA FRAPT

表1 TNBC和癌旁组织基因差异表达前10的候选基因Tab.1 Top 10 candidate genes differentially expressed in TNBC and adjacent tissues

2.2 沉默lncRNA FRAPT对TNBC细胞生长和细胞周期的影响 敲低lncRNA FRAPT 可显著抑制MDAMB-231 细胞生长，24 h 后细胞增殖能力始终低于阴性对照组，72 h时差异有统计学意义（si-lncRNA FRAPT-1#：t= 9.731，P= 0.010 4；si-lncRNA FRAPT-2#：t=6.913，P=0.002 3），见图3。与阴性对照组相比，silncRNA FRAPT-1#和si-lncRNA FRAPT-2#组S期细胞占比明显降低（t分别为21.35和20.77，P均＜0.000 1），细胞周期被阻滞在G1期，见图4和图5，提示lncRNA FRAPT在TNBC细胞中发挥重要功能。

图3 敲低lncRNA FRAPT 对MDA-MB-231 细胞增殖的影响Fig.3 Effect of knocking down lncRNA FRAPT on proliferation of MDA-MB-231 cells

图4 TNBC细胞周期变化情况的流式细胞图Fig.4 Flow cytometry of cell cycle changes in TNBC cells

图5 沉默lncRNA FRAPT对TNBC细胞周期的影响Fig.5 Effect of silencing lncRNA FRAPT on TNBC cell cycle

2.3 沉默lncRNA FRAPT 对TNBC 细胞耐药性的影响 沉默lncRNA FRAPT 的TNBC 两个细胞系对PTX的耐药性均降低。处理72 h后，与阴性对照组相比，si-lncRNA FRAPT-1#和si-lncRNA FRAPT-2#组MDA-MB-231 和HCC1806 细胞对PTX 的耐药性均显著降低（t分别为51.43和49.85，P分别为0.004和＜0.001；t分别为11.00 和14.10，P分别为0.008 2 和0.001）。见图6。表明在沉默lncRNA FRAPT 的两个细胞系中，PTX 有效性较阴性对照组得到显著增强，lncRNA FRAPT 在TNBC 中高表达增强了肿瘤细胞的耐药性。

图6 敲低lncRNA FRAPT 的HCC1806（A）和MDA-MB-231细胞（B）对PTX的耐药性Fig.6 PTX resistance of HCC1806（A）and MDA-MB-231（B）cells knocked down lncRNA FRAPT

3 讨论

乳腺癌是女性中最常见的恶性肿瘤，2018 年全球约有210万乳腺癌新发病例和63万乳腺癌死亡病例，乳腺癌发病率和死亡率均居女性癌症第1位［10-11］。目前乳腺癌的治疗方法通常包括手术、放疗、化疗、内分泌治疗以及靶向治疗，尽管这些方法明显提高了乳腺癌患者的生存率，但治疗后复发和转移的问题仍然未得到很好解决。尤其是TNBC与其他乳腺癌相比，具有异质性高、发病年龄早、临床分期晚且更易复发和转移等特点，且TNBC不表达ERα、PR、Her-2，缺少有效的治疗靶点，不能进行内分泌治疗和抗Her-2靶向治疗，一般采用化疗［14-15］。因此，亟待对乳腺癌发生发展的关键调控因子进行深入研究，以便寻找有效的治疗方法。

PTX 是乳腺癌治疗中常用的化疗药物，但乳腺癌细胞对PTX的耐药性严重影响临床治疗效果［16-17］。目前，乳腺癌细胞产生耐药性的机制尚不清楚。基因的异常表达可能影响肿瘤对PTX 等化疗药物的敏感性。lncRNA 参与调控肿瘤细胞化疗耐性，可作为逆转肿瘤化疗耐性的分子靶点。

许多研究表明，lncRNA 在生命活动中具有重要的调节功能。lncRNA表达失调可导致多种疾病甚至肿瘤发生，且其在乳腺癌的发生发展过程中起重要作用［7，18-21］。本研究数据库分析发现，lncRNA FRAPT 在乳腺癌组织和细胞中表达增加，提示其在乳腺癌中发挥重要作用。lncRNA FRAPT是一条全新的lncRNA，目前尚未见报道。本研究发现，lncRNA FRAPT 可显著促进TNBC 细胞的增殖、细胞周期，且可以在肿瘤细胞中高表达。干扰lncRNA FRAPT的表达降低了TNBC细胞系MDA-MB-231和HCC1806对化疗药物PTX的敏感性。在此基础上，结合lncRNA FRAPT 反义寡核酸反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides，ASO）抑制剂，加上化疗药物的使用，可为TNBC 的进展和耐药性提供新的思路，也为TNBC 的治疗提供新的策略。

综上所述，TNBC 组织和细胞中lncRNA FRAPT高表达，敲低lncRNA FRAPT 可显著抑制TNBC 细胞的增殖、细胞周期，并增强了TNBC 细胞对化疗药物PTX的敏感性。进一步明确了lncRNA FRAPT在TNBC中的作用具有重要意义和潜在临床价值。本研究为体外细胞学实验，后期需要从动物实验及临床队列研究的角度进一步进行验证。