听花酒对大鼠性功能和外周血白细胞端粒长度的影响

倪子寒 许晓燕 李芳 余梦瑶

酗酒导致性功能损害和衰老，已得到广泛认可。在性功能研究方面，Van Thiel等早在20世纪80年代就总结认为，慢性酒精滥用可损伤下丘脑-垂体-性腺功能，并进一步损伤男性生殖功能。Peugh等总结前人研究资料认为，急性大剂量饮酒和慢性酒精滥用会明确损伤男性性功能。过量饮酒对女性月经周期、激素分泌、卵泡发育、子代发育都有不利影响。而在衰老研究方面，Dixit等研究认为，酗酒能够减少端粒长度。Topiwala等发现酒精和端粒长度之间存在潜在的阈值关系，过量饮酒会缩短端粒长度。

然而，适度饮酒对人体性功能和衰老的影响则存在较大争议。例如，Cheng等和Chew的两项回顾性研究认为，少量到中等的慢性酒精饮用对男性ED有改善作用，而Maugeri等研究发现，在没有酒精滥用和依赖的情况下，饮酒对端粒长度没有影响。

听花酒是以优质白酒为原酒，通过定向菌和特制香曲二次发酵、精馏浓缩等专有的白酒减害增益工艺酿制而成，具有同时激活交感与副交感神经的双激活作用。前期研究发现，听花酒对男性、女性性激素和血清NO含量有一定的改善作用。适度长期饮用听花酒对人体性功能和衰老有何影响，目前尚未明确。本研究拟通过对大鼠交配行为、动情周期、血清激素水平、生殖器官脏器系数和组织病理、血清及主要性器官NO浓度和NOS活力及外周血白细胞端粒长度的影响研究，评价听花酒对大鼠性功能和外周血白细胞端粒长度的作用。

一、材料

1.试验动物。雄性大鼠性功能和外周血白细胞端粒长度试验雄性SD大鼠，SPF级，48只，体重200-220g；雌性SD大鼠，SPF级，60只，体重180-200g，均购自四川省中医药科学院实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK（川）2018-19。

雌性大鼠性功能和外周血白细胞端粒长度试验采用雌性SD大鼠，SPF级，48只，体重220-240g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（湘）2019-0004。

以上动物均饲养于四川省中医药科学院实验动物中心SPF屏障系统内，实验动物使用许可证号：SYXK（川）2018-100）。

2.试验样品与试剂。听花酒（酱香风格白酒，53°），宜宾听花酒业发展有限责任公司提供，批号：20220309。听花酒临用前分别用蒸馏水稀释4、8、16倍，密封置于4℃保存，72h内使用完毕。酱香原酒（53°），宜宾听花酒业发展有限责任公司提供，批号：20220322。酱香原酒临用前用蒸馏水稀释8倍，密封置于4℃保存，72h内使用完毕。食用酒精（95%），购自成都市长联化工试剂有限公司，批号：20211228。将食用酒精用蒸馏水稀释至53%，密封置于4℃保存。临用前取53%食用酒精以蒸馏水稀释8倍，密封置于4℃保存，72h内使用完毕。

苯甲酸雌二醇注射液（2mL：4mg），兽药字：120032511，批号：20220201，购自合肥新科信动物药业有限公司。黄体酮注射液（1mL：50mg），兽药字：120031439，批号：20220201，购自合肥新科信动物药业有限公司。

血清睾酮（T）ELISA试剂盒、促卵泡激素（FSH）ELISA试剂盒、黄体生成素（LH）ELISA试剂盒、雌二醇（E2）ELISA试剂盒、孕酮（P）ELISA试剂盒，购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司。NO测定试剂盒、总一氧化氮合成酶（NOS）测试盒、总蛋白测定试剂盒、HE染液，购自南京建成生物工程研究所。DNA提取试剂盒、荧光定量PCR试剂盒、DNA Marker，购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

其余试剂均为国产分析纯。

二、方法

1.动物分组与给药。动物适应性饲养7d后，按体重随机分为6组——正常组、食用酒精组、酱香原酒组、听花高剂量组、听花中剂量组、听花低剂量组，每组8只。食用酒精组每日灌胃8倍稀释的53%食用酒精，灌胃体积1mL/100g体重，相当于每日饮用53%食用酒精1.25mL/kg。酱香原酒组每日灌胃8倍稀释的酱香原酒，灌胃体积1mL/100g体重，相当于每日饮用酱香原酒（53）1.25mL/kg。听花高剂量组、听花中剂量组、听花低剂量组每日灌胃4倍、8倍、16倍稀释的听花酒，灌胃体积1mL/100g体重，分别相当于每日饮用听花酒（53）2.5mL/kg、1.25mL/kg、0.625mL/kg。正常组灌胃蒸馏水，灌胃体积1mL/100g体重。各组动物均连续灌胃30d。

2.对雄性大鼠交配行为的影响。交配行为试验雌性动物的准备：交配试驗前14d，雌性大鼠腹腔注射350mg/kg水合氯醛麻醉，腹部两侧开口，分离两侧卵巢及子宫。结扎子宫末端后剪去卵巢，缝合创面。每只大鼠腹腔注射青霉素10万U，连续3d。手术后自由饮食。交配行为试验前48h，每只雌性大鼠皮下注射苯甲酸雌二醇40μg；交配行为试验前4h，每只雌性大鼠皮下注射黄体酮500μg，使之处于动情期。

给药结束后当日，在19：00-23：00时测定雄性大鼠的交配行为。实验室保持安静，灯光要微弱、暗红，将雄性大鼠单独放入交配盒中5min以适应环境，然后每盒放入处于动情期的雌性大鼠1只，观察并记录从雌鼠投入至雄鼠首次骑跨雌鼠的时间（骑跨潜伏期）、雄鼠首次插入的时间（插入潜伏期）、雄鼠首次射精的时间（射精潜伏期），以及骑跨次数、插入次数和射精次数。若大鼠未发生骑跨、插入、射精行为，则相应行为潜伏期记为1200s。统计20min内各组发生骑跨、插入、射精的动物数，计算骑跨百分率、插入百分率和射精百分率。

3.对雌性大鼠动情周期的影响。自给药第17d起，每日两次（8：00-9：00、20：00-21：00）对雌性大鼠进行阴道脱落细胞涂片检测，确定动情周期阶段，连续14d。参考Hubscher等的方法进行操作。将大鼠倒放在手掌上，用移液器吸取20μL生理盐水，轻轻插入大鼠阴道，反复冲洗5下，吸出抽吸液并滴于载玻片上，涂片，在显微镜下观察。动情周期阶段判定标准如表1所示。

4.对大鼠血清激素水平的影响。给样结束后，大鼠以350mg/kg水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主动脉采血，2000rpm离心10min，收集血清，-80℃下保存备用。按相应ELISA试剂盒说明书操作流程，分别测定血清T、FSH、LH、E2、P激素水平。

5.对大鼠生殖器官脏器系数和组织病理的影响。大鼠采血后，解剖雄性大鼠阴茎、睾丸、附睾、前列腺、包皮腺、精囊腺和雌性大鼠阴道、卵巢、子宫并称重，计算脏器系数。脏器系数（g/100g体重）=（脏器质量/大鼠体重）×100。取左侧睾丸、附睾、部分阴茎及前列腺、包皮腺、精囊腺和左侧卵巢、子宫、部分阴道于4%多聚甲醛中固定，制备石蜡切片，HE染色，观察组织病理形态。

6.对大鼠血清和主要性器官NO、NOS的影响。取右侧睾丸、附睾及部分阴茎和右侧卵巢、子宫及部分阴道，分别称重后剪碎，加入9倍体积生理盐水，于冰浴中匀浆，匀浆经3000rpm离心10min，收集上清液。按试剂盒说明书测定大鼠血清和主要性器官组织匀浆上清液中NO含量和NOS活性。

7.对雄性大鼠阴茎组织cGMP含量的影响。取阴茎匀浆上清液，按ELISA试剂盒说明书操作流程，测定阴茎组织cGMP含量。

8.外周血白细胞端粒长度测定。按照DNA提取试剂盒说明书，提取大鼠血液DNA，用琼脂糖电泳检测DNA质量，并计算浓度。参考Cawthon和Shoeb方法设计引物（表2）。荧光定量PCR反应体系（50μL）为：2×SG Fast qPCR Master Mix 25μL，基因组DNA（20ng/μL）1μL，正向、反向引物（10μM）各2μL，超纯水补足至50μL。端粒PCR条件为：预变性95℃ 3min，扩增20个循环：95℃ 30s，54℃ 2min，72℃ 10s，循环完成后进行熔解曲线分析。AT1 PCR条件为：预变性95℃ 3min，扩增40个循环：95℃ 30s，58℃ 1min，72℃ 10s，循环完成后进行熔解曲线分析。PCR反应完成后，采用icycler软件计算各样品Ct值，应用2-ΔΔCt法得出端粒相对长度。

三、结果

1.听花酒对大鼠体重及一般状态的影响。在所有时间点，各组大鼠体重未见显著性差异（P>0.05）。整个给药过程中，除听花高剂量组动物在第一周给药后，出现自发活动减少、耳廓皮肤变红等表现外，其余時间各组动物均未见一般状态的异常改变。

2.听花酒对雄性大鼠交配行为的影响。雄性大鼠交配行为试验结果显示（表3），食用酒精组骑跨、插入、射精潜伏期均较正常组有较大幅度延长，但没有显著性差异（P>0.05）；骑跨、插入和射精次数较正常组减少，其中插入和射精次数具有显著性差异（P<0.05）。与食用酒精组比较，听花低剂量组和中剂量组骑跨、插入、射精潜伏期有一定幅度的缩短，但没有显著性差异（P>0.05）；插入和射精次数显著增加，具有显著性差异（P<0.05）。同时发现，与酱香原酒组相比，听花中剂量组骑跨、插入、射精潜伏期有一定幅度的缩短，而骑跨、插入、射精次数有一定提高。

3.听花酒对雌性大鼠动情周期的影响。观察雌性各组动物的动情周期发现（表4），与正常组比较，食用酒精组动情前期、动情期、动情后期时间缩短，动情间期延长，但无显著性差异（P>0.05）；与食用酒精组比较，听花低、中、高剂量组动情前期、动情期均有所延长，而动情间期缩短，但无显著性差异（P>0.05）。

4.听花酒对大鼠血清激素水平的影响。雄性大鼠血清激素测定结果显示（表5），食用酒精组T略有降低，听花各剂量组T较食用酒精组均有所提高，但不具有显著性差异（P>0.05）。同时，听花低、中剂量组T较酱香原酒组也有所提高。雌性大鼠血清激素测定结果显示（表6），听花各剂量组T较正常组、食用酒精组、酱香原酒组均有一定提高，但不具有显著性差异（P>0.05）。与酱香原酒比较，听花各剂量组P有升高，听花中、高剂量组的P高于正常组，听花高剂量的E2高于正常组和酒精组，但不具有显著性差异（P>0.05）。

5.听花酒对大鼠生殖器官脏器系数和组织病理的影响。解剖发现，各组雌、雄大鼠的生殖器官质地、色泽、大小等无明显异常改变。比较脏器重量（表7、表9）和脏器系数（表8、表10）发现，雄性动物中，食用酒精组睾丸、附睾重量和系数较正常组有所减少，而前列腺重量和系数有所增加，但不存在统计学差异（P>0.05）。与食用酒精组比较，听花中剂量组睾丸重量和系数有所增加，前列腺重量和系数有所降低，但未见显著差异（P>0.05）。雌性动物中，与正常组比较，食用酒精组卵巢重量和系数有所减少，子宫、阴道重量和系数有所增加；与食用酒精组相比，听花低、中、高剂量组卵巢重量和系数均有所增加，子宫、阴道重量和系数有所减少，但不具有显著性差异（P>0.05）。

6.听花酒对大鼠血清和主要性器官NO、NOS的影响。雄性动物NO、NOS测定结果显示（表11、表12），食用酒精组阴茎匀浆中NO浓度较正常组有显著降低（P<0.05），听花酒低剂量组和中剂量组与食用酒精组相比阴茎匀浆中NO浓度升高，具有显著性差异（P<0.05），同时听花各剂量组阴茎NO均高于酱香原酒组。食用酒精组阴茎匀浆中NOS活性较正常组有显著降低（P<0.05），听花酒低剂量组和中剂量组与食用酒精组相比阴茎匀浆中NOS活性升高，其中小剂量组有极显著差异（P<0.01），中剂量组有显著性差异（P<0.05），两者较酱香原酒组也有一定提升。

雌性动物NO、NOS测定结果显示（表13、表14），听花酒各剂量组阴道NO较食用酒精组和酱香原酒组都有一定提高，低、高剂量组NO含量高于正常组，但未见显著性差异（P>0.05）。听花酒各剂量组阴道NOS活性均较正常组、食用酒精组、酱香原酒组有所提高（P>0.05）。

7.听花酒对雄性大鼠阴茎组织cGMP含量的影响。结果表明（表15），与正常组相比，食用酒精组阴茎匀浆中cGMP含量显著降低（P<0.05），而听花各剂量组阴茎匀浆中cGMP含量较食用酒精组有一定恢复，其中低剂量组与食用酒精组相比具有显著性差异（P<0.05）。

8.听花酒对大鼠外周血白细胞端粒长度的影响。根据表16、17可知，与正常组比较，食用酒精组外周血白细胞端粒相对长度大幅减少，雄性、雌性分别缩短11.88%和11.00%，但未见显著性差异（P>0.05）。与正常组相比，听花酒各剂量组端粒相对长度无明显变化，但与食用酒精组相比，听花酒各剂量组端粒相对长度有所恢复，雄性动物低、中、高剂量组分别较食用酒精组增加16.85%、13.48%、8.99%，雌性动物低、中、高剂量组分别较食用酒精组增加10.11%、11.23%、8.99%，但也未见显著性差异（P>0.05）。

四、讨论

酒可助性这句话，在古今中外的文化中有着广泛的认可度，但也一直受到大量质疑。酗酒可导致性功能损害已获得广泛认可，但适度饮酒对人体性功能的作用则存在争议。一些研究认为饮酒对性功能的复杂影响，可能与其在心理学和药理学两方面相互作用的结果相关。

听花酒作为一种采用特有的减害增益工艺酿造的白酒，适量长期饮用对人体性功能有何作用，目前尚未研究。为此，本研究以不引起大鼠出现醉酒状态的最大剂量2.5mL/kg为起点，采用2.5mL/kg、1.25mL/kg、0.625mL/kg剂量连续灌胃雄性大鼠30d，通过测定对大鼠交配行为、动情周期、血清激素水平、生殖器官脏器系数和组织病理、血清及主要性器官NO浓度和NOS活力的影响，评价听花酒对大鼠性功能的影响。

雄性大鼠交配行为结果显示，食用酒精能够显著降低雄性大鼠插入和射精次数（P<0.05），并在一定程度上延长骑跨、插入、射精潜伏期，而听花酒低、中剂量组与食用酒精组相比能够显著增加插入和射精次数（P<0.05），并缩短骑跨、插入、射精潜伏期，且与正常组相比无显著性差异（P>0.05）。同时，与酱香原酒组相比，听花中剂量组骑跨、插入、射精潜伏期有一定幅度的缩短，但骑跨、插入、射精次数有一定提高。以上结果表明，听花酒不会引起在同等剂量食用酒精组中出现的性功能明显下降，且与酱香原酒组表现相比也有一定提升。雌性大鼠动情周期结果显示，与食用酒精组比较，听花低、中、高剂量组动情前期、动情期均有延长趋势，而动情间期有缩短趋势，尽管无显著性差异，但提示听花酒可能减少食用酒精对雌性动情周期的影响。

睾酮是维持雄性性功能的最重要激素，也与女性性欲有密切關系。血清激素检测发现，尽管未见显著性差异，但在雄性和雌性大鼠中，听花酒各剂量组T含量均较食用酒精组和酱香原酒组更高，甚至在雌性大鼠中高于正常组，提示听花酒可能对食用酒精引起的T降低有恢复作用，且效果优于酱香原酒。

生殖器官解剖和组织病理检测发现，听花酒对雄性和雌性生殖器官脏器系数和组织病理均无显著影响（P>0.05），提示在本试验剂量和时间条件下，听花酒不会引起大鼠生殖系统的明显改变。

NO作为一种信号分子和一种活性氧物质，在生殖系统中发挥着重要而复杂的生理作用和病理作用，被认为是诱发阴茎平滑肌松弛和海绵体充盈产生勃起的主要物质，此外还具有抑制血小板在血管内皮表面聚集粘附的作用，防止阴茎勃起时海绵体血窦内血栓的停滞。食用酒精能够显著降低雄性大鼠阴茎NO含量和NOS活性（P<0.05），而听花低、中剂量组NO含量和NOS活性显著高于食用酒精组（P<0.05），且与正常组相比没有显著差异（P>0.05），并优于酱香原酒组。在阴道中，NO还对阴道血流的调节以及平滑肌的松弛起主要作用。本研究发现，尽管没有显著性差异，但听花酒各剂量组雌性大鼠阴道NO含量和NOS活性较食用酒精组、酱香原酒组都更高，提示听花酒在改善雌性阴道NO相关功能方面也具有有益作用。

NO/cGMP途径是调控勃起功能的重要途径之一，cGMP作为NO下游信号分子激活后续级联反应。本研究也发现，食用酒精组阴茎匀浆中cGMP含量显著降低（P<0.05），而听花各剂量组阴茎匀浆中cGMP含量较食用酒精组有一定恢复，其中低剂量组与食用酒精组相比具有显著性差异（P<0.05），并优于酱香原酒组。

以上结果提示，听花酒能够避免食用酒精引起的阴茎NO含量下降和NOS活性降低，并且增强NO/cGMP途径信号强度。

一些研究表明，酒精摄入量与死亡率之间存在U型曲线关系，适度饮酒与衰老的关系尚无定论。近年来，一些研究试图利用端粒长度来评价适度饮酒与健康的关系。端粒是位于线性染色体末端的DNA-蛋白结构，具有维持基因组稳定性的作用。由于真核生物DNA复制的固有机制，每次有丝分裂均会导致端粒缩短，当缩短到一定长度时，细胞即停止分裂进入衰老状态，进而发生细胞功能退化与凋亡。除与衰老相关以外，端粒还作为DNA损伤的分子信标激活修复机制或在极端情况下启动细胞死亡途径。Topiwala等研究发现，酒精和端粒长度之间存在潜在的阈值关系，过量饮酒可能会缩短端粒长度。Maugeri等研究发现，在没有酒精滥用和依赖的情况下，饮酒对端粒长度没有影响。

本研究发现，1.25mL/kg食用酒精连续灌胃雄性、雌性大鼠30d，可使其外周血白细胞端粒长度有较大幅度减少，而灌胃2.5mL/kg、1.25mL/kg、0.625mL/kg听花酒，动物外周血白细胞端粒长度较正常组无明显变化，且较食用酒精组有所恢复。尽管以上结果虽未见统计学差异（P>0.05），但数据趋势提示，食用酒精可能对大鼠外周血白细胞端粒相对长度有缩短作用，听花酒中除乙醇外的其他发酵组分可能提高食用酒精所致端粒缩短作用的阈值，使端粒相对长度维持在与正常组相当的水平。

综合上述研究结果可以发现，食用酒精能够引起雄性大鼠交配行为变弱、阴茎NO含量降低和NOS活性下降等性功能不利改变，并表现出缩短外周血白细胞端粒长度趋势，而听花酒能够避免食用酒精的上述不利影响，且部分指标优于酱香原酒，提示其在特殊的减害增益酿酒工艺中形成的某些活性物质能够拮抗乙醇对机体性功能和端粒长度的不利影响。饮酒对人体性功能的影响是神经心理学和药理学两方面的综合结果，本研究侧重于从药理学方面评价听花酒的作用，可能与人体试验中包含神经心理学和药理学两方面因素的实验结果有所差异，因此，听花酒对人体性功能的研究还有待进一步深入探索。而在衰老研究方面，适度饮用听花酒更长的时间是否能够延缓端粒磨损，或者听花酒较普通白酒对端粒缩短有更高的阈值，也是未来可以开展的研究内容。