摘叶和喷施外源过氧化氢对库尔勒香梨粗皮果形成的影响

史智勇,艾沙江·买买提,仙米斯娅·塔依甫,曹艺洁,玉苏甫·阿不力提甫

(1.新疆农业大学林学与园艺学院,乌鲁木齐 830052;2.新疆农业科学院园艺作物研究所,乌鲁木齐 830091;3.新疆维吾尔自治区农药检定所,乌鲁木齐 830049 )

0 引 言

【研究意义】库尔勒香梨(PyrussinkiangensisYü)是新疆梨和西洋梨的自然杂交后代,食用品质优良[1]。库尔勒香梨粗皮果的形成降低了其食用品质和经济效益。研究库尔勒香梨粗皮果形成的规律,为库尔勒香梨粗皮病的防治提供相关理论基础,对提高果实品质具有重要意义。【前人研究进展】目前有关库尔勒香梨粗皮果形成的研究主要集中在砧木、矿质元素、生长调节剂、树体营养状况、结果部位等的影响[2-4];环境因子对于香梨粗皮果的形成也有较大的影响,如干旱[5]、光照条件[6]等。库尔勒香梨粗皮果的形成不仅是树体的内部作用,也是树体对外界环境信号响应,是复杂的信号传递过程。逆境胁迫是非生物胁迫的一种,也是植物在正常生长中经常会面临的一种胁迫类型。李英丽[7]发现高温处理能够显著增加鸭梨果实内活性氧含量的积累,且高温和强光具有胁迫增效作用,能够加重氧化胁迫的发生。石细胞含量的增多是库尔勒香梨粗皮果形成的主要原因,而在石细胞快速形成的时期,其质外体活性氧产生基因也在高水平表达[8]。且活性氧对于石细胞的主要成分木质素[9]的合成有一定的促进作用[10-11],活性氧胁迫和高温强光胁迫会促使香梨的粗皮果的产生。【本研究切入点】库尔勒香梨粗皮病是一种生理病害。发病果实的果面凸凹不平,并且萼端由绿变黄的速度减慢,对果实品质影响较大。需研究库尔勒香梨上可能诱导粗皮果形成的胁迫因子。【拟解决的关键问题】设置不同的胁迫类型,测定果实染色切片的相关生理指标,研究胁迫作用对库尔勒香梨粗皮果形成的影响,分析库尔勒香梨粗皮果形成相关的胁迫类型,为解决库尔勒香梨粗皮果的产生提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

以新疆巴音郭楞蒙古自治州轮台县轮台果树资源圃的长势相同的多年生库尔勒香梨树为试验材料,随机选取每棵树上相同方向的枝条为1个试验组,3棵树为1个平行组,共9棵树。

1.2 方法

1.2.1 试验设计

空白(CK)组:不处理。

摘叶(Y)组:在2021年7月5日,摘除遮挡结果枝光照50%的叶子(高温光照复合胁迫);外源喷施H2O2(H)组:在2021年5月5日,任意选取3个结果枝用250、400和500 mmol/L H2O2喷施预处理,观察果子的生长发育情况。以果实表型不发生改变的最大临界浓度作为试验处理浓度(活性氧胁迫)。

400和500 mmol/L H2O2喷施组果实表型均产生明显病变,而250 mmol/L H2O2喷施组表型未产生明显病变,于2021年7月5日对整个H组的结果枝用250 mmol/L的外源H2O2喷施。图1

图1 外源喷施H2O2预试验组

1.2.2 测定指标

1.2.2.1 环境因素

分别在CK组和Y组结果枝上各选取5个果子,选取7月连续晴朗的3 d,每隔2 h测定果面的光照度和温度。

光照强度采用TES 1332A数位式照度计测定;采用FLUKE MT4 MAX辐射温度计测定温度。

1.2.2.2 生理指标

分别选取不同处理组枝条上的果实(花后100 d)若干,用蒸馏水清洗干净后分别削取果皮以及果皮下2 mm左右的果肉,果皮果肉分别用液氮速冻后用 IKA A11 磨样机磨成粉末状混样,做好采样标签,存于-80℃ 冰箱中备用。

采用硫酸蒽酮比色法测定植物纤维素含量[12];采用盐酸水解法测定植物半纤维素含量,采用浓硫酸法测定植物木质素含量[13];可溶性蛋白采用考马斯亮蓝染色法测定;可溶性糖和淀粉含量采用蒽酮试剂法测定[14];丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法测定[15];脯氨酸含量采用酸性茚三酮法测定[16];过氧化氢含量和超氧阴离子含量分别用索莱宝公司(Solarbio)的过氧化氢含量试剂盒(BC3590)和超氧阴离子含量试剂盒(BC1290)进行测定;酶活性测定利用赛默飞世尔(Thermo Fisher)酶标仪(1510)测定。

1.2.3 田间比例

在香梨果实成熟期,即2021年8月20日该对空白组以及2个处理组枝条上的所有果实的粗皮果和正常果数量并汇总。

1.2.4 果实石细胞染色

随机选取不同处理组的香梨果实(花后100 d)若干,用蒸馏水清洗后分别对果实进行横切与纵切。横切与纵切的果实切片宽度约2 cm,厚度约5 mm,长度需要从果皮切到果核附近,用50% FAA固定液进行固定保存;香梨果实用番红固绿染色液进行染色。

香梨果实的脱水和浸蜡通过徕卡组织样品自动脱水机(Leica ASP200S)完成;香梨果实的包埋通过徕卡包埋机(Leica Arcadia H+C)完成;香梨果实的切片通过徕卡切片机(Leica RM2265)完成;香梨果实切片的染色通过徕卡摊片机(Leica HI 1210)、徕卡烘片机(Leica HI 1220)、徕卡自动染色机(Leica ST5020)完成。

1.3 数据处理

所有数据采用 Excel 2010 软件进行汇总和处理,利用SPSS 26.0进行数据分析,利用 GraphPad Prism 7.0 进行作图。

2 结果与分析

2.1 胁迫相关因子变化

2.1.1 摘叶组环境因子

研究表明,摘叶导致果实表面的光照强度以及温度显著增加。Y组果实表面的光照度明显大于CK组,Y组的日平均光照度约为CK组的日平均光照度的18倍;Y组日平均温度比CK组的日平均温度高3.6℃。摘叶能使果实表面的光照和温度明显增加,对果实造成温度和光照的复合胁迫。图2

注:A图为日光照变化;B图为日温度变化

2.1.2 不同胁迫因子对香梨果皮活性氧含量的影响

研究表明,喷施外源H2O2能导致库尔勒香梨果皮中的H2O2含量明显升高。H组H2O2含量约为CK组的2.0倍,并且也显著高于其他2个处理组。外源喷施250 mmol/L H2O2能对库尔勒香梨果皮造成一定的活性氧胁迫,而摘叶处理则没有对库尔勒香梨果皮造成明显氧化胁迫或胁迫程度较小。图3

注:数据(平均值±标准差)后用不同小写字母表示在P<0.05 差异显著;无标注即代表没有显著性差异,下同

2.1.3 不同胁迫处理对库尔勒香梨果实MDA含量的影响

研究表明,H组果肉中的MDA含量明显高于CK组,为CK组的1.8倍。喷施250 mmol/L H2O2对果实的胁迫作用更加明显,而摘叶处理对香梨果实MDA含量几乎没有影响。图4

注:数据(平均值±标准差)后用不同小写字母表示在P<0.05 差异显著

2.2 不同胁迫因子对内源渗透物质的影响

研究表明,摘叶处理后,果皮和果肉中的可溶性糖含量和果肉中的淀粉含量均显著性升高,分别为对照组的1.4、1.2倍和2.0倍;果肉中的可溶性蛋白显著下降,相比对照组下降了49%。外源H2O2处理后,果皮中的可溶性糖和淀粉含量均显著升高,分别为对照组的1.4倍和1.4倍;果皮中的脯氨酸含量显著下降,相比对照组下降了14%。图5

图5 库尔勒香梨果实不同处理组内源渗透物质含量变化

2.3 胁迫处理对库尔勒香梨粗皮果形成的影响

2.3.1 胁迫处理对库尔勒香梨粗皮果率的影响

研究表明,3种胁迫处理均能导致香梨的粗皮果率显著升高。H组果实的粗皮果率为CK组的2.9倍,Y组果实的粗皮果率是CK组的1.6倍。且H组相对Y组均导致了其结果枝的粗皮果率的显著升高。表1

2.3.2 胁迫处理对库尔勒香梨组织染色切片的影响

研究表明,2种不同的胁迫处理后切片单位视野中石细胞的数量均体现出增加的趋势。其中, H组染色图中单位视野内的石细胞数量相对于Y组色图中单位视野内石细胞数量增多趋势更加明显。与田间调查中的3个处理组对粗皮果率的结果相一致,活性氧胁迫对于果实内部石细胞含量的增多以及粗皮果的形成有较大的影响,高温光照复合胁迫对于果实内部石细胞含量的增多以及粗皮果的形成影响较小亦或光照强度没有达到对果实产生逆境胁迫的程度。图6

表1 库尔勒香梨结果枝不同处理组的粗皮果率变化

2.3.3 胁迫处理对库尔勒香梨果实细胞壁物质含量的影响

研究表明,2种处理,果皮、果肉的木质素含量都有所增加。H组果皮和Y组果肉的木质素含量与CK组相比有显著升高,H组果皮果肉和Y组果肉中的纤维素含量与CK组相比有显著升高,H组果皮果肉和Y组果肉的半纤维素含量与CK组相比有显著提高。H2O2喷施处理对果皮的木质素、纤维素、半纤维素含量以及果肉中的纤维素、半纤维素含量有显著影响;摘叶处理对果肉中木质素含量、纤维素含量、半纤维素含量以及果皮中的半纤维素含量有显著影响。图7

注:A～C. CK,H,Y组的果实果皮附近染色图,1、2、3分别为外果皮部位同一切片上的全景扫描图的3个连续片段3段不同部位;a～c.处理组CK,H,Y组的果实果肉部分染色图

注:A、B、C分别为果皮、果肉中木质素含量、纤维素含量、半纤维素含量;数据(平均值±标准差)后用不同小写字母表示在P<0.05 差异显著

3 讨 论

库尔勒香梨的粗皮果的形成原因较为复杂。徐庆岫等[5]认为7月的高温干旱是导致粗皮果形成的主要原因;李疆等[3]通过对库尔勒香梨进行田间调查,发现内膛枝、树势旺盛以及凸顶果和凹顶果的比率升高都会导致粗皮果率升高;此外,也有报道喷施钙溶液可以影响南果梨粗皮果率[17]。香梨粗皮果的形成,不仅是树体内部自身作用的结果,更是树体对逆境环境的响应的结果。研究发现摘叶处理和喷施H2O2后果实果皮中的活性氧含量显著增加,处理对香梨果实产生一定程度的氧化胁迫,其中H2O2处理的作用更明显,所有影响细胞氧化还原状态的胁迫因子都有潜力诱导粗皮果的产生。逆境胁迫会导致植物体内活性氧含量的升高[18],植物细胞在自身承受范围之内通过保护酶系统或渗透调节物质来清除多余的活性氧来防御逆境胁迫[19-20]。胁迫处理后香梨果实内可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸等渗透调节物质不同程度的提高,果实细胞确实感受到逆境胁迫,并对其做出响应。当逆境胁迫程度超过细胞的承受范围后,植物组织为了整张发育主动牺牲部分细胞来适应逆境环境,即通过细胞程序性死亡(Programmed cell death,PCD)来促进部分细胞的分化[21]。其结果一是为剩余细胞的正常代谢活动提供能量;二是将部分细胞分化为厚壁组织或输导组织的一部分来提高组织对逆境的适应性[22-23]。库尔勒香梨粗皮果的形成是其果实中石细胞增多的结果,石细胞是由于木质素沉积而导致次生壁加厚的细胞分化过程[11,24]。

前期的研究中发现在石细胞形成的关键时期与质外体活性氧产生相关的酶基因显著上调表达,且表达趋势与石细胞的变化趋势大致相同,石细胞分化和质外体活性氧积累之间存在协同关系。在果实发育的早期石细胞主要分布在维管束周围,而维管束周围的细胞一般处于一种“半分化”的状态,后期不利的环境因素会优先导致维管束周围的薄壁细胞进行分化[8,25]。库尔勒香梨果实在受到一定的环境胁迫条件下,如外源的活性氧胁迫和高温光照复合胁迫,会导致库尔勒香梨的石细胞增多,相对应的处理组枝条的粗皮果率也会显著增加。逆境胁迫、活性氧爆发、PCD、次生壁沉积这四者相结合,共同促进了库尔勒香梨果实中石细胞的增多,进而导致粗皮果的产生。

4 结 论

4.12种处理均能显著提高库尔勒香梨果实内的木质素含量和处理枝条上的粗皮果率。2种处理后果皮的木质素含量以及粗皮果率分别为对照组的1.4、2.9倍和1.1、1.6倍。

4.2其中摘叶处理后,果肉中的渗透调节物质相对变化较为明显,主要影响果肉中的石细胞积累;喷施H2O2后果皮中的ROS代谢相关物质、MDA含量以及渗透调节物质变化都较为明显,主要影响果皮中的石细胞积累。