NaN3 诱变草莓突变体的表型筛选与SRAP 分子鉴定

彭安妹，徐梦琴，毛敏，何克勤，胡能兵，兰伟，崔广荣

（安徽科技学院农学院，安徽 凤阳 233100）

红花草莓开红花、结红果，具有三小叶，色彩鲜明［1］，其植株可用于盆栽观赏和园林绿化［2］。我国对红花草莓进行育种的时间不长、育成品种不多、果实品质欠佳、花色单一（主要为粉色）［3-4］，红花草莓育种一直停留在传统的杂交育种阶段［5-7］，这使得红花草莓的应用得到了限制。而化学诱变育种技术凭借其操作简易，特异性较强并且诱变后代遗传比较稳定的特点，已经在许多作物上得到了广泛运用［8］。化学诱变剂叠氮化钠（NaN3）可透过细胞膜进入细胞内，通过碱基替换方式使DNA的正常合成受到影响，引起点突变的产生［9］。崔广荣等［10］采用NaN3对文心兰原球茎进行诱变处理，成功获得了突变体植株；王霞等［11］采用NaN3对凤尾鸡冠花叶片进行处理，成功筛选出耐盐突变体；何克勤等［12］采用NaN3对甜叶菊试管苗进行诱变处理，得到突变体植株。有关红花草莓的NaN3离体化学诱变研究尚未见报道。

形态学标记因其具有简易、快速，不需要高昂仪器设备等特点［13］，在育种鉴定中常见报道［10-17］，但是形态学鉴定容易受到环境因素和人为因素的影响，只能作为初步鉴定。而分子标记技术不易受到环境等因素的影响，可以从遗传物质DNA水平来研究植物基因的变化，具有操作更简单，结果更精确的特点［18］。SRAP分子标记是一种基于PCR的新型分子标记［19］，其具有操作简单、易重复性和高共显性等优点。本研究采用NaN3诱变红花草莓植株，在形态学初筛的基础上，进一步采用SRAP 分子标记技术进行多态性检测，通过聚类分析鉴定了红花草莓与其23 株突变单株的遗传背景和亲缘关系，以期筛出突变体，为红花草莓新品种培育提供参考和奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

由安徽科技学院分子育种实验室提供的纯系红花草莓品种。

1.2 试剂

SRAP 引物的合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成；10×DNA buffer 、TaqDNA 聚合酶（5 U/μL）、Marker等均购自北京康为世纪生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 诱变材料获取 2021 年8 月在预备试验基础上，用1 mmol/L NaN3对草莓试管苗诱变处理1 d后移入增殖培养基中培养28 d，继代两次后转入生根培养基中，25 d后转入穴盘炼苗，30 d后移栽至安徽科技学院温室大棚中，共得到M1代诱变单株500 株。

1.3.2 表型性状调查 2022 年春对500 株诱变单株进行田间表型鉴定，观察记录株高、冠幅、茎粗、叶面积、叶型、叶色、花色、花型、果形。 突变体筛选标准采用Wei等［20］的方法，入选标准为：入选株性状＞对照平均值±3倍标准差。

1.3.3 SRAP 分子鉴定 2022 年4 月采用CTAB法对发生表型突变的草莓植株幼嫩叶片进行DNA提取，参考胡能兵［21］的方法。采用浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳对DNA 进行质量检测。挑选主条带清楚并且干扰条带少的8 对引物（表1）来检测表型性状突变体的多态性。采用胡能兵等［22］的SRAP反应体系进行扩增。采用 Sanguinetti等［23］的银染方法进行染色。

表1 选用SRAP引物名称及序列Table 1 Name and sequence of SRAP primers selected

1.4 数据统计与分析

通过EXCEL 2007 软件进行数据转换，分别计算红花草莓表型突变植株的株高、冠幅、茎粗、叶面积的均值（X） 和标准差（SD）。采用 NTsys 2.10软件进行统计和聚类分析。

2 结果与分析

2.1 表型突变植株筛选

由表2可得，表型突变主要为株型、茎叶、花和果实4 种突变类型，在整个生育期共发现23 份表型突变株，突变率为4.6%，其中部分突变株存在多类型突变。

表2 红花草莓突变类型的表型统计Table 2 Phenotypic statistics of mutant types in pink flowered strawberry

2.1.1 株型突变 由表2 和图1 可知，株型突变主要包括株型紧凑、株高变矮2 种类型。共有4 份，突变率为0.8%。其中，株型紧凑的有2 株，突变率为0.4%。与对照冠幅（25～46.5 cm）相比，主要表现为冠幅变小（冠幅减少13.54～21.29 cm）。植株矮化的有2 株，突变率为0.4%，与对照株高（20～35 cm）相比，主要表现为茎长度缩短（株高减少13.54～15.54 cm）。

图1 草莓部分诱变植株株型突变田间表型Figure 1 Field phenotype of stem mutation in some mutagenic strawberry plants

2.1.2 茎叶突变 由表2 和图2 可知，茎叶突变主要包括茎纤细、小叶、叶片皱缩卷曲和花叶4种类型。共有8份，突变率为1.6%。其中，茎纤细的突变株有1株，突变率为0.2%，与对照茎粗（1.99～3.01 cm）相比，表现为茎变细（减少1.08 cm）。叶面积变小的有4株，突变率为0.8%。叶片皱缩卷曲的植株有2株，突变率为0.4%。花叶突变体1 株，突变率为0.2%，表现为叶片颜色黄绿相间。

图2 草莓部分诱变植茎叶突变田间表型Figure 2 Field phenotypes of leaf mutations in some mutagenic plants of strawberry

2.1.3 花突变 由表2 和图3 可得，花突变主要包括白色花、三色花、花瓣短缩花和球型花4种类型（图3），共有8份，突变率为1.6%。其中，白色花4份，突变率为0.8%。三色花1 份，突变率为0.2%，表现为一朵花上同时出现深粉色、粉色、白色3种颜色的花瓣。花瓣短缩花2份，突变率为0.4%，表现为一朵花上的2 个花瓣短缩，发育不良。球型花突变体1 份，突变率为0.2%，表现为花型由平面展开型变为圆球型，并且花蕊由圆形变为长椭圆形。

图3 草莓部分诱变植株花突变田间表型Figure 3 Field phenotype of flower mutation in some mutagenic plants of strawberry

2.1.4 果实突变 由表2 和图4 可知，果实突变为果形突变。共有3份，突变率为0.6%。其中，长圆锥形果1份，突变率为0.2%，表现为果实变细长，由圆锥形变为长圆锥形。球型果1份，突变率为0.2%，表现为果形变圆变小。矩形果1份，突变率为0.2%，表现为果实膨大，形状接近矩形。

图4 草莓部分诱变植株果实突变田间表型Figure 4 Field phenotype of fruit mutation in some mutagenic plants of strawberry

2.2 SRAP分子鉴定

2.2.1 SRAP 标记的扩增多态性分析 利用SRAP分子标记对23株草莓表型突变植株进行遗传多态性进行分析（图5）。8对SRAP引物扩增出的片段大小主要在100～1 000 bp，每1 对引物扩增出的总条带数在4～15条不等。8对SRAP引物扩增出的总条带数为72，多态性条带数为47，多态性比例为65%，其中引物A18Z14扩增出的多态性条带是最多的，扩增出10 条多态性条带（图5）。与CK 相比，部分表型突变植株的条带出现了3种变化，具体表现为条带新增，条带缺失，条带既新增又缺失。

图5 部分引物的草莓突变体SRAP扩增图谱Figure 5 SRAP amplification map of pink flowered strawberry mutant with partial primers

2.2.2 突变植株与对照的遗传差异性比较 由图6可以看出，与对照相比，除了突变植株N-15没有出现遗传上的变异以外（虽然株高矮化明显），其他22株突变植株都出现了遗传上的变异。其中与对照在遗传距离上相差最远的是N-5、N-8 和N-9，产生的变异最大，它们分别通过8对引物扩增出12、13和15态性条带，说明通过NaN3处理引起了这些突变植株较多基因位点上的突变，与对照植株相比，这3株突变植株在形态上表现为花型与花色的变异，其中N-5表现为花型由平面展开型变为圆球型，并且花蕊由圆形变为长椭圆形。N-8和N-9花色均由粉色变为白色。

图6 突变植株和对照的聚类树状图Figure 6 Cluster dendrogram of variants plants and CK plants

3 讨论

目前在草莓育种上化学诱变主要是用EMS 进行诱变，张经纬等［24］用EMS 来处理丰香草莓的种子，突变率为1%。田前进等［25］用EMS 对草莓组培苗和叶片外植体进行处理，突变率为4.38%。本研究采用NaN3对红花草莓不定芽进行诱变处理，突变率为4.6%，与田前进和张经纬的结果不完全一致，本研究中出现的花色和花型突变性状，在田前进和张经纬的研究中未出现。在这23株表型突变株中，部分突变体同时产生2种或3种复合性状变异，如花叶突变体同时产生了白色花性状，叶片皱缩卷曲突变体同时产生了白色花性状，茎纤细突变体同时产生株高变矮和小叶性状。这表明不同性状的变异发生在同一单株上是可能的。孙加焱等［26］用60CoY 射线和EMS处理甘蓝型油菜，复合变异性状比例占总突变群体的36.60%。

本研究出现的大部分突变体为无益突变体，有益突变体如白色花、三色花和球型花突变体的突变率分别为0.8%、0.2%和0.2%。其中三色花和球型花突变体在以往红花草莓育种中从未见报道过，极具观赏价值。这些有益突变体可以作为育种材料使用。

SRAP分子标记在很多植物鉴定工作中得到广泛应用［27-28］。本研究中SRAP 标记结果表明，红花草莓M1代表型突变植株在 DNA 水平发生了基因突变，其中23 株突变株中有22个单株在 DNA水平发生了基因突变，而没有发生DNA水平变化的1株为株高变矮突变株，其表型变化可能是由于植株营养不良或者环境影响造成的，本试验结果获得22株表型突变株既在表型上发生变化又在分子水平发生变化。但存在的问题是，这些表型上的变异能否遗传给后代，是否为基因水平上可遗传的变异，这需要进一步对M2代植株进行观察。