原油对潮间带泥蚶抗氧化酶活性影响初步探究

刘铭华，侯伟芬，陈帆，徐青霞，潘玉英,2，杨灿灿，林子涵，韦丹，杨金生

(1.浙江海洋大学水产学院，浙江舟山 316022；2.浙江省海洋渔业装备技术研究重点实验室，浙江舟山 316022；3.浙江海洋大学石油化工与环境学院，浙江舟山 316022)

随着现今全球经济快速发展，能源需求与日俱增，海洋石油开采和运输也稳步增长，海洋石油污染也愈发严重[1]。海洋石油污染不仅给海洋渔业经济带来破坏性影响，也对海洋及潮间带生物造成巨大危害。石油中的多种成分都能对生物产生一定的毒性，并且石油中的烃类还可以通过生物间营养级转换达到毒性富集，因此这种发生在食物链上的积累性危害是难以预测的[2]。作为海洋生态系统的重要组成部分，潮间带不仅对海洋渔业和河口生产力起着不可忽视的作用，还可以为大洋地区营养盐提供重要补充[3]。由于潮间带是海陆交汇部分，其生态平衡易受人类活动干扰，石油污染更会使潮间带生态系统过度负担[4]。石油污染生物降解作用与潮间带地区的营养盐和溶解氧含量有一定的相关性[5]，且沉积物中的石油污染物短期内不易去除[6]。因此，研究原油对潮间带生物的毒理效应在评估海洋石油泄漏造成的潮间带生态破坏方面具有重要的理论意义。

生物标志物是指示污染物危害效应的生物信号。由于抗氧化防御系统会参与清除机体中毒产生的物质，因此在研究污染物对生物的致毒效应方面通常都以抗氧化酶活性变化为标志物[7]。生物体内的抗氧化系统可以在机体中毒时第一个做出反应，在保护机体中扮演着重要角色。超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽硫转移酶(GST)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)是4 种常用的抗氧化酶生物标志物。近年来，前人在实验和野外条件下，开展了一些污染物对生物抗氧化系统的影响的研究工作，其中也有污染物对贝类抗氧化酶活性影响变化的一些研究[8-13]。

泥蚶Tegillarca granosa一般较多聚集于内湾及河口附近的潮间带上，其数量于潮间带中、低潮区最多，埋藏栖息于淤泥之中。泥蚶生活习性对于潮间带沉积物原油污染开展实验十分契合，是开展实验的优选对象。前人研究发现，生物体中位于鳃和肝脏中的靶细胞是石油污染引起抗氧化酶系统影响的主要部位[14]。鳃作为绝大部分海洋生物的呼吸器官，呼吸作用是原油等污染物进入生物体重要形式[15]；位于内脏团中的肝脏是生物体内解毒主要器官[16]，也常被选做生物毒性效应的实验组织。泥蚶暴露于原油中，鳃和内脏团酶活性变化可作为描述石油污染下生物生理机能情况的重要生物标志物。通过研究泥蚶鳃和内脏团4 种酶活性(包括SOD、CAT、GST 和GPx)在其暴露于不同浓度原油中72 h 的变化趋势，探讨泥蚶暴露于原油中的毒性效应，探索是否可以将泥蚶鳃和内脏团抗氧化酶活性作为监测海洋早期原油污染的生物标志物。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器

紫外-可见光分光光度计(上海美谱达仪器有限公司，UV-1100B 型)，高速离心机(宁波群安电子科技有限公司，JOANLAB MC-12Pro)，恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司，HWS-24)，旋涡混合器(常州越新仪器制造有限公司，XH-C)，移液枪(Eppendorf)，电子天平(上海花潮电器有限公司，UTP-313)。

1.1.2 试剂

SOD、CAT、GST、GPx 和蛋白质测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)，所用正己烷、无水乙醇等均为分析纯。

1.2 实验原油

实验原油取自浙江省舟山市岙山岛，原油成分如图1 所示，其中生物标志物主要包括三环萜烷、降藿烷、升藿烷、奥利烷、胆甾烷、孕甾烷、伽马蜡烷、莫烷等。

图1 原油组成成分Fig.1 Composition of crude oil

1.3 海水与沉积物

实验海水为天然海水过滤后备用，盐度为23，预先由充氧泵充分充氧。

沉积物取自浙江省舟山长峙岛潮间带，风干后过1 mm 和2 mm标准筛按照质量比1：1 混合备用。

1.4 实验设计

实验装置由6 个浓度(将6 个不同浓度区分为低、高2 个浓度组，其中低浓度组：0、500、1 000 和1 500 mg·kg-1；高浓度组：10 000 和15 000 mg·kg-1)，每个浓度3 个平行共计18 个海水和沉积物混合养殖箱组成，污染浓度为原油和沉积物干重质量比，其中0 mg·kg-1为空白对照组。用电子天平按照预设浓度准确称量实验原油，与养殖箱中5 kg 风干沉积物混匀，接着将5 kg 海水缓慢均匀地倒入养殖箱，静置备用，并在每个框内配备25 W 功率充氧泵1 台放在插置于沉积物中塑料瓶内，进行对实验干扰较小的充氧过程，保证泥蚶成活率(图2)。

图2 模拟生境养殖箱示意图Fig.2 Schematic diagram of the simulated habitat breeding box

实验生物泥蚶购买于浙江省舟山市新城金岛老街菜市场，平均壳长为(3.02±0.16) cm，平均壳宽(2.12±0.12) cm，平均壳高(2.32±0.14) cm，平均壳重为(10.36±0.13) g，将泥蚶放置在无原油环境养殖箱中进行为期5 d 暂养，每个箱内准确放入25 只泥蚶，暂养期间用微型充氧泵24 h 不停息充氧，每天1 次将养殖箱内海水换出50%以上(暂养期间更换海水均已用充氧泵充氧)，暂养期间不投喂，水温基本恒定在18.8 ℃，盐度为24.5。暂养结束后，将泥蚶转移至上述准备养殖箱中。实验期间，每2 天1 次将每个箱中海水换出50%以上，实验期间条件与暂养期相同。

在污染暴露第72 h 取样。每次每个养殖箱取泥蚶2 只，活体解剖，取出鳃和内脏团，经过冰纯水和生理盐水冲洗后，用镊子小心夹取于吸水纸上吸干水分，称量后迅速放入冻存管于液氮中进行冷冻，再将冷冻好的冻存管样品放在冰箱里进行超低温保存。测定时，从冰箱中取出样品，置于冰上器皿内并加入准确计量的生理盐水进行研磨操作，磨至无明显大块组织后装入2 mL 离心管中，使用漩涡混匀器进行混匀，然后于离心机中进行转速2 500 r·min-1离心。取上清液，用于酶活性测定。

1.5 酶活性测定

于1.4 中获得上清酶液，按照考马斯亮蓝法测定蛋白浓度[17]；SOD、CAT、GST 和GPx 酶活性测定均按照试剂盒说明进行操作。

1.6 数据分析及诱导倍数计算

实验数据使用SPSS 软件进行统计学方法处理，通过单因素方差分析原油暴露引起的差异；采用t检验法对组间数据进行两两比较，P＜0.05，认为是差异显著；所给出结果均为平均值±标准差。浓度组中酶活性大于其对照组酶活性，为诱导；反之，则为抑制。

由于原油浓度差异对生物组织酶活性也会出现不同程度抑制或者诱导，于是通过计算生物酶活性诱导倍数可以进一步探索泥蚶体内抗氧化酶活性在污染暴露过程中变化。

式中：I为诱导倍数；Ni和N分别为各浓度组和对照组酶活性。

2 结果

2.1 泥蚶鳃和内脏团4 种抗氧化酶活性差异

统计对照组泥蚶体内4 种抗氧化酶活性，如表1 所示。泥蚶鳃中SOD、CAT 和GST 酶活性高于内脏团，内脏团中GPx 酶活性则高于鳃。由于各组织结构和功能不同，且酶与酶间也存在着差异，使得同一种酶在不同组织中表现出酶活性差异。

表1 泥蚶鳃和内脏团中4 种抗氧化酶活性差异Tab.1 Differences in activities of four antioxidant enzymes in gills and viscera mass

2.2 不同浓度原油对泥蚶SOD 酶活性影响

如图3a 所示，泥蚶鳃SOD 活性随原油浓度增加呈升高——降低趋势，且各污染组与对照组中SOD 酶活性差异均不显著(P＞0.05)。其中，在500 和1 000 mg·kg-1实验组时，SOD 酶活性被诱导高于对照组，分别是对照组的1.07 倍和1.06 倍，其中酶活性最大为500 mg·kg-1浓度组210.22 U·mgprot-1；而1 500、10 000和15 000 mg·kg-1浓度组SOD 酶活性则低于对照组，分别是对照组0.82 倍，0.83 倍和0.84 倍，其中酶活性最小值只有159.46 U·mgprot-1。

图3 不同浓度原油对泥蚶鳃(a)和内脏团(b)SOD 酶活性影响Fig.3 Effects of different concentrations of crude oil on SOD enzyme activities in the gills (a) and visceral mass (b)of the T.granosa

如图3b 所示，泥蚶内脏团中SOD 酶活性随原油暴露浓度增加呈降低——升高——降低趋势，且各污染暴露组与对照组中SOD 酶活性差异均不显著(P＞0.05)。在500、1 500、10 000 和15 000 mg·kg-1浓度组时，SOD 酶活性均是受到抑制低于对照组，其中，15 000 mg·kg-1浓度组SOD 酶活性是最小值只有67.22 U·mg prot-1，是对照组0.82 倍；而1 000 mg·kg-1浓度组SOD 酶活性是最大值且高于对照组达到88.73 U·mgprot-1，是对照组1.08 倍。

2.3 不同浓度原油对泥蚶CAT 酶活性影响

如图4a 所示，泥蚶鳃中CAT 活性随原油浓度变化呈降低——升高——降低趋势，且各污染组与对照组中酶活性差异均不显著(P＞0.05)。其中，在500 mg·kg-1实验组时，CAT 活性受到诱导高于对照组，是对照组1.01 倍；在1 000 和1 500 mg·kg-1污染组时，CAT 酶活性则低于对照组，分别是对照组0.94 倍和0.84 倍；在10 000 mg·kg-1原油污染组中，CAT 酶活性受到诱导达到最大值203.12 U·mgprot-1，且高于对照组，是对照组1.06 倍；而在15 000 mg·kg-1污染暴露组时CAT 酶活性又低于对照组，且达到最小值133.69 U·mgprot-1，是对照组0.7 倍。

图4 不同浓度原油对泥蚶鳃(a)和内脏团(b)CAT 酶活性影响Fig.4 Effects of different concentrations of crude oil on CAT enzyme activities in the gill (a)and visceral mass (b)of the T.granosa

如图4b 所示，泥蚶内脏团CAT 活性随着原油浓度变化呈升高——降低趋势，且各实验组中CAT 活性均大于对照组，且无显著差异(P＞0.05)。其中，在500、1 000、1 500 和10 000 mg·kg-1浓度组浓度变化时，CAT 酶活性逐渐增大，在10 000 mg·kg-1浓度组CAT 酶活性达到最大值72.01 U·mgprot-1，是对照组1.13倍；在浓度为15 000 mg·kg-1时，相较于10 000 mg·kg-1浓度组下降但仍高于对照组。

2.4 不同浓度原油对泥蚶GST 酶活性影响

如图5a 所示，泥蚶鳃GST 酶活性随原油暴露浓度增加呈升高——降低——升高趋势，且各污染组中GST酶活性与对照组均无显著差异(P＞0.05)。其中，在暴露原油浓度为500 mg·kg-1实验组中，其GST 活性受到诱导高于对照组达到485.45 U·mgprot-1，为对照组1.26 倍；而在原油浓度为1 000、1 500 和15 000 mg·kg-1浓度组GST 酶活性都低于对照组，分别是对照组0.78 倍、0.53 倍和0.69 倍；在10 000 mg·kg-1浓度组时，泥蚶鳃GST 酶活性低于对照组达到最小值193.90 U·mgprot-1，是对照组0.5 倍。

图5 不同浓度原油对泥蚶鳃(a)和内脏团(b)GST 酶活性影响Fig.5 Effects of different concentrations of crude oil on GST enzyme activity in gills (a) and visceral mass (b) of T.granosa

如图5b 所示，泥蚶内脏团GST 酶活性随原油暴露浓度变化呈降低——升高——降低趋势。各个原油浓度组GST 活性都显著低于对照组(P＜0.05)，其中500、1 000、1 500 和15 000 mg·kg-1浓度组分别是对照组0.49倍、0.64 倍、0.45 倍和0.46 倍，而原油浓度为10 000 mg·kg-1浓度组酶活性只有46.14 U·mgprot-1，是对照组0.15 倍。

2.5 不同浓度原油对泥蚶GPx 酶活性影响

如图6a 所示，泥蚶鳃GPx 活性随原油暴露浓度变化呈升高——降低——升高趋势。泥蚶鳃暴露于500 mg·kg-1实验组时，GPx 受到诱导，酶活性显著高于对照组(P＜0.05)，此时GPx 酶活性高达85.29 U·mgprot-1，为对照组2.76 倍；另外，10 000 mg·kg-1浓度组酶活性与对照组也表现出差异显著性(P＜0.05)酶活性被诱导达到78.12 U·mgprot-1，为对照组2.53 倍。之后随暴露组浓度增加，GPx 酶活性降低，在15 000 mg·kg-1浓度组时达到最低值56.40 U·mgprot-1，但各浓度组GPx 酶活性均高于对照组。

图6 不同浓度原油对泥蚶鳃(a)和内脏团(b)GPx 酶活性影响Fig.6 Effects of different concentrations of crude oil on GPx enzyme activities in gills (a) and visceral mass (b) of the T.granosa

如图6b 所示，在暴露72 h 之后，泥蚶内脏团中GPx 酶活性变化趋势大致呈现为升高——降低——升高的趋势，且各污染组中GPx 酶活性与对照组无显著差异(P＞0.05)。其中，泥蚶内脏团暴露在1 000 mg·kg-1实验组中时，GPx 酶活性受到诱导达到峰值44.11 U·mgprot-1，为对照组1.07 倍；剩余各污染组GPx 酶活性均低于对照组。

2.6 4 种酶最大诱导倍数差异

泥蚶鳃和内脏团中SOD、CAT、GST 和GPx 酶活性最大诱导倍数差异如表2 所示。内脏团SOD、CAT最大诱导倍数均高于鳃(P＞0.05)，而鳃GPx 最大诱导倍数显著高于内脏团(P＜0.05)，另外，内脏团GST最大诱导倍数不存在。除了CAT 最大诱导倍数发生在较高浓度(10 000 mg·kg-1)，其余均产生在较低浓度(≤1 000 mg·kg-1)。

表2 泥蚶鳃和内脏团4 种酶活性最大诱导倍数差异Tab.2 The maximum induced multiple differences of the four enzymes in gills and visceral mass

3 讨论

多个抗氧化酶构成的抗氧化系统作为生物重要防御体系，在生物体受到外部环境胁迫时，参与Ⅰ相和Ⅱ相反应催化污染物生成代谢物，并对机体内的异常量活性氧(ROS)自由基进行清除[18-19]。SOD 是一种能够催化发生歧化反应将生物体内超氧化物转化为氧气和过氧化氢的酶，可以使得细胞免受氧化破坏[20]，已有报道将抗氧化酶作为鱼类氧化胁迫的生物标志物[21-22]。有研究表明，在污染物浓度低的情况下SOD 活性会出现升高趋势，而在污染物浓度较高时SOD 活性常会降低，这使得对生物体有害的活性氧会在机体内累积，对生物体造成伤害[23]。本实验结果显示泥蚶内脏团SOD 活性呈降低——升高——降低的趋势；泥蚶鳃组织中各浓度组SOD 活性呈升高——降低趋势，与前人实验结果相同[23]，而内脏团在500 mg·kg-1浓度组酶活性抑制于对照组，鳃组织却没有出现这种情况，表明原油进入机体器官组织的先后顺序会对不同组织某些酶活性产生不同结果。杨涛等[24]研究发现，污染时间与浓度不同，SOD 活性诱导存在差异性，反映了生物对有毒化合物响应存在明显适应阈值。在低浓度组，SOD 活性随着原油浓度变化而上升，说明泥蚶为减少原油污染物暴露造成的伤害，其机体应激反应产生了大量的SOD，来清除过量自由基。而1 500 mg·kg-1和高浓度组SOD 活性被抑制，可见1 500 mg·kg-1为其阈值浓度，而当生物体自身调节能力不足以适应原油污染作用时会出现中毒反应[25]。原油浓度高，产生自由基的速率远超过了抗氧化酶自我清除的速率和最大限度，造成SOD 酶活性降低，导致机体细胞受到损伤[24]。

CAT 可以催化细胞中过氧化氢(H2O2)分解，具有防止机体细胞过氧化的作用。在外界污染压力下，机体内自由基增多，使得细胞膜过氧化，进而造成细胞膜破坏和损伤[26]。本实验研究发现，随着原油浓度增大，泥蚶内脏团CAT 活性表现出先升高后降低变化趋势，这可能是由于在低浓度原油影响下，为减少生物体内激增的自由基，CAT 活性开始升高，以催化细胞内过氧化氢分解，使得机体受损概率大幅减小。随着暴露浓度增加，高浓度原油影响已经超过了CAT 可以调节的平衡限度，因而CAT 活性降低。高永刚等[27]在研究栉孔扇贝Chlamys farreri也有相似结论，杨宝等[26]认为这可能和实验过程中产生可以抑制CAT 活性的O2-有关。

GST 属于Ⅱ相反应酶类，可以催化GSH 和某些外部污染性物质形成易排出体外的疏水性化合物，具有促进解毒作用[19]。在双壳类生物体内，GST 酶活性较高，且在各个组织中都存在[26]。本实验研究发现，泥蚶鳃GST 活性高于内脏团，陈荣等[28]发现僧帽水母Ostrea cucullata鳃GST 活性也会高于其他组织。有研究表明GST 活性随着浓度变化呈升高——降低趋势[28-29]。任加云等[30]将栉孔扇贝暴露在多氯联苯中，发现在低浓度处理下其GST 活性升高，高浓度影响下则降低。然而，也有研究和此结果不一致。前人发现银鲫Carassius auratus gibelioGST 活性在暴露4 周时才被诱导[31]；陈家长等[19]研究表明罗非鱼Oreochromis mossambicus暴露于BaP 中24、48 和96 h 其肝脏浓度组酶活性与对照组没有显著区别。本实验显示泥蚶鳃GST 活力首先被诱导升高随着污染浓度增加而开始降低抑制，这与在苯并[a]芘B(a)P 污染条件下梭鱼Mugil soiuyGST 活性均有先诱导后抑制相似变化趋势[29]一致，在15 000 mg·kg-1浓度组虽有上升趋势但酶活性依旧处在抑制阶段。而泥蚶内脏团各浓度组均显著抑制于对照组，各浓度组酶活性变化随浓度增大呈升高——降低——升高的较不稳定趋势，可以通过增加浓度梯度来进一步探索。王重刚等[29]猜测除了生物种类异同外，可能与污染物种类和浓度不同以及暴露时间有关。由于生物暴露于原油污染中各个器官组织接触污染时间、浓度都大不相同，影响生物各部位组织酶活性自然会不同。因此，前人在探索GST 活性时，出现GST 活性诱导、抑制等多种情形，除了污染物种类等几种变量不同之外，还可能和不同的器官组织有关。

GPx 是机体内重要的过氧化物分解酶，能够清除异常量的过氧化物以保持机体平衡[32]。本实验研究表明，泥蚶鳃和内脏团中GPx 酶活性在低浓度组中随着原油浓度增大呈升高——降低趋势，李传慧等[33]在半滑舌鳎Cynoglossus semilaevis幼鱼原油暴露实验中发现肝脏GPx 酶活性随着浓度增加而先升高后降低；段美娜等[34]也在马粪海胆Hemicentrotus pulcherrimus实验中有类似发现。泥蚶鳃和内脏团GPx 酶活性暴露在500 和1 000 mg·kg-1浓度时上升，表明此时生物体内抗氧化酶开始对过量ROS 进行清除，使细胞免受损伤，从而维持机体正常代谢[35]；而随着原油浓度增大，酶活性明显下降，说明此时GPx 酶活性受到了抑制。本研究中泥蚶鳃和内脏团低浓度组GPx 活性呈先被诱导后被抑制趋势，这与本研究中SOD 和CAT 活性变化规律一致，SOD、CAT 二者和GPx 之间可能存在相关性。杨涛等[24]认为SOD 歧化反应后的产物H2O2恰好是GPx 的作用底物，导致二者变化规律一致，而CAT 和GPx 活性提高以清除代谢中产生的H2O2，使生物体不受到较大氧化损伤。

观察发现，鳃中4 种抗氧化酶活性及峰值均高于内脏团。对比最大诱导倍数(表2)，除了CAT 其余3种酶最大诱导倍数均产生于500 mg·kg-1浓度组，表明相较于内脏团，在外源性污染物存在的情况下鳃更容易出现酶活性诱导现象，这可能是原油中有机物通过鳃进入生物体内后，参与生物体代谢过程产生大量ROS，导致ROS 剧增而出现代谢失衡，以致机体受到氧化损伤。因此，GPx 诱导并通过催化作用与对机体有损伤的过氧化物反应，减少ROS 的产生量并将其清除，缓和细胞的氧化[35-36]。通过对比不同原油浓度对泥蚶鳃和内脏团酶活性变化的差异显著性，发现仅鳃中GPx 酶活性发生显著诱导现象(图6a)，这说明泥蚶鳃GPx 对原油毒性效应更明显。总之，鳃的4 种抗氧化酶活性均大于内脏团，泥蚶鳃组织GPx 酶活性表现出显著诱导，且在各个酶的最大诱导倍数中鳃组织中的GPx 最大。因此，相较于其他酶，GPx 更适合作为监测原油污染的有效生物标志物。

4 结论

(1)暴露在原油72 h 内泥蚶鳃SOD、GST，内脏团CAT 和低浓度组GPx 酶活性随着原油浓度增加总体表现为先升高后降低趋势，并且存在一定剂量——效应关系。

(2)泥蚶鳃中SOD、CAT 和GST 酶活性高于内脏团，内脏团中GPx 酶活性则略高于鳃，且鳃GST 和GPx 酶活性最大诱导倍数比内脏团高，而SOD 和CAT 鳃和内脏团最大诱导倍数无较大差异，表明泥蚶鳃对原油污染更加敏感。

(3)结合酶活性及诱导倍数大小，泥蚶鳃GPx 酶活性更灵敏，可作为早期海洋原油污染监测的生物标志物。