淮山药零余子60Co-γ辐射的诱变效应

胡泊　宾丽慧　容敏坚　黄学华　胡永杏　古彪

关键词：淮山药；零余子；60Co-γ 辐射；诱变效应；M1 代单株选择

中图分类号：S632.1 文献标识码：A

淮山药，属薯蓣科（Dioscoreaceae）薯蓣属（Dioscorea L.）一年生或多年生缠绕性藤本块茎类植物，在我国已有2500 年以上的栽培历史。淮山药品种资源丰富，20 世纪60—70 年代植物资源调查发现，我国有薯蓣科植物1 属6 组约49种[1-2]。通常，南方习惯称之为淮山，北方则称之为山药。有学者从植物生态学角度提出，我国淮山药品种大体上分为北方型品种和南方型品种两大生态类型[3]，并指出它们之间主要在植物学性状、适应性、品质、产量、抗逆性等方面均存在较大差异。淮山药块茎主要含淀粉，不同淮山药种类的块茎大小差异很大，小的与马铃薯一般，大的长度可超过2.5 m，重达7.5 kg[4]。形状各异，有球状、圆柱状、椭圆、扁平等，有单胞的，也有多胞的；块茎有不分枝的，也有分枝的。目前生产上的淮山药品种多为块茎长条形、单胞、不分枝品种，其他类型的应用较少。淮山药是集医药、养生、保健、食用、饲用于一体的高效率经济作物[5]，甚至可以代粮，发展潜力巨大，产业前景广阔。

辐射诱变育种是利用物理诱变因素如γ 射线等，诱发植物性状产生遗传变异，获得有利用价值的突变体，从而选育出新品种或新种质资源的育种方法[6]。1969 年，联合国粮农组织（FAO）与国际原子能机构（IABA）联合出版发行了《突变育种手册（Manual on Mutation Breeding）》，这被认为是植物辐射诱变育种从初期基础研究到实际应用转折的标志[7]。与常规育种相比，辐射诱变育种有提高基因突变率、打破性状连锁和促进基因重组、克服植物自交不亲和性、促进远缘杂交结实等潜在优势，是一种较为简单、能够稳定变异且具有高繁殖效率等优势的育种手段[8]，较传统育种高效、快速，较转基因育种更为经济，是产生新品种的主要手段之一。进入20 世纪70年代，辐射诱变育种已经成为一种有效的育种手段并得到了迅速发展，在水稻、小麦、玉米、豆类、果树等品种选育中取得了大量成果。相对而言，马铃薯、甘薯、淮山药等薯类作物辐射育种研究较少。尤其是淮山药育种，在有限的育种实践中方法手段比较单一，目前主要以种质收集、自然变异单株系统选育和引种为主[9-10]。利用辐射人工创造淮山药变异的育种方法，迄今仅见刘艳芝等[11]对北方型淮山药品种进行诱变处理的报道。

本试验以南方生态型淮山药品种桂淮5 号零余子为材料，开展60Co-γ 辐射诱变效应研究，在有效剂量范围内，分别采用40、60、80、100 Gy剂量梯度对试验材料进行辐射处理，通过田间试验对经辐射处理的零余子M1 代发芽率、植株生长发育、结薯形态特征等研究分析，并围绕育种目标对变异单株进行选擇，以便探讨淮山药零余子60Co-γ 辐射诱变性状变异的效应，测试明确桂淮5 号零余子辐射的半致死剂量、临界剂量，获取具有性状表现差异的辐射M1 代单株，探讨淮山药辐射育种的可行性，并为后继的品种、品系选育提供基础材料。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为南方生态型本地淮山药品种桂淮5 号零余子，来自广西桂平市淮山药种植户，2020年11 月采收。所用零余子经人工检选，大小均匀、饱满，表面色泽较一致、无伤损、无病虫害，平均粒重为8.3 g。

1.2 方法

1.2.1 辐射剂量范围的测试 刘艳芝等[11]关于淮山药零余子有效辐射剂量，以及史玮[12]关于马铃薯、张建斌等[13]关于香蕉60Co-γ 辐射诱变的相关研究资料，所采用的辐射剂量相互之间悬殊较大。为了测试找到适合桂淮5 号淮山药零余子的有效剂量范围，减少盲目性，提高工作效率，本研究在正式试验前做了一个较大剂量梯级、较宽剂量范围的预备试验。预备试验具体做法：采用辐射剂量分别为30、60、90、120、150、180 Gy，剂量率为1.0 Gy/min，对试验材料零余子进行60Co-γ 射线辐射处理，以未经辐射的为对照，共7个处理。每个处理零余子100 颗，不设重复。辐照处理后当天，将各处理的零余子单层排放到垫有多层湿纸巾的托盘上，表面覆盖单层湿纸巾，置于温度28 ℃、湿度80%的培养箱进行催芽。每天观察记录一次萌芽（露白）情况，连续5 d 不再增加萌芽视为萌芽终止，统计各处理发芽数、发芽率，结果如表1。

预备试验结果只做定性判断不做差异显著性分析。结果表明，辐射剂量≥120 Gy 的各处理催芽期内均没有萌芽，可视为达到或超过致死剂量；而辐射剂量30 Gy 时，发芽率不降反升，高于对照8 个百分点，其原因可能与适当剂量辐射对零余子萌发的生理生化过程具有正面效应有关，需要进一步研究，但至少说明该剂量及低于该剂量没有对受试零余子产生明显胁迫损伤和诱变效应。因此，可以判断≤30 Gy、≥120 Gy 对诱变而言无实际意义，在正式试验时可以将其排除。

1.2.2 零余子辐射处理 根据预备试验测试结果，本试验采用40 ～100 Gy 作为适用剂量范围，设置了4 个辐射剂量梯度处理，以未经辐射的为对照，共5 个处理。60Co-γ 射线辐照处理于2021年4 月21 日由广西南翔环保有限公司辐照中心（广西深圳辐照公司）施行，辐射剂量分别为40、60、80、100 Gy，剂量率为1.0 Gy/min。每个处理零余子数为300 颗。

1.2.3 辐射处理零余子的田间种植 经辐射处理后的零余子，于2021 年4 月22 日播种于广西农业科学院蔬菜研究所试验基地设施种植大棚。大棚四面通透，棚顶透光不透雨；棚长30 m，宽10 m；地块土壤条件良好，土层深度约25 cm，装备水肥一体化滴灌设施。深耕耙碎后起垄，垄高约30 cm，垄间距1.6 m。每处理设3 个重复，每个重复种植零余子100 颗。株、行距为20 cm20 cm，双行种植。

1.2.4 田间调查 从种植后第5 天起，每隔5 d观察一次发芽出苗情况，以发芽露出地面1～3 cm肉眼明显可见为准，记录各处理的出苗数，并对已计数的苗作标记。连续5 d 不再出现苗数增加，视为出苗终止，统计各处理出苗总数、发芽势、发芽率、相对发芽率。发芽势＝最高峰时的发芽数/播种数100%；发芽率=发芽数/播种数100%；相对发芽率＝处理发芽率/对照发芽率100%。收获时，计数株数、结薯数；观测薯形、单株胞数、块茎分枝；测量薯长、圆径，平均单薯重，测定各处理总产薯重量；将入选单株单独标记收藏，以便M2 代种成株行观察目标性状的遗传性和进行株系选育；单株选择余下的其他材料，以处理为单位混合收藏，M2 代以处理为单位种成混合小区继续观察选择。

1.3 数据处理

应用SPSS 25.0 和Excel 软件对数据进行方差及回归分析。

2 结果与分析

2.1 不同辐射剂量处理对淮山药零余子发芽率的影响

田间调查结果显示：对照的淮山药零余子发芽率为86.0%；Gy40 处理的发芽率为92.7%，比对照高，相对发芽率为107.8%；此外，60～100 Gy各处理的发芽率均比对照低，且在此剂量范围内，辐射剂量越高，发芽率越低。60 Gy 处理的发芽率为59.7%，相对发芽率为69.4%；80 Gy 处理的发芽率为28.7%，相对发芽率为33.4%；100 Gy处理的发芽率为4%，相对发芽率为4.7%。差异性统计分析显示，除40 Gy 处理的发芽率高于对照且达显著水平外，60～100 Gy 各处理与对照之间及其相互间的发芽率，均随剂量的提高而下降，且达到极显著水平（表2）。在一定剂量范围内，60Co-γ 射线对淮山药品种桂淮5 号零余子发芽具有明显的抑制、损害作用，剂量越高抑制、损害作用越大，零余子发芽率越低。

但是，40 Gy 处理的发芽率与本试验另外3个剂量处理的结果完全不同，比对照处理不降反升，且差异显著，说明适当较低剂量的60Co-γ 照射可能对淮山药零余子的萌发有促进作用，有待进一步研究。

2.2 半致死剂量和临界剂量的确定

使用Excel 软件，以辐射剂量0（CK）、40、60、80、100 Gy 及其对应发芽率为基础，拟合一元线性回归方程y=bx+a，并利用“回归－线性”参数求算决定系数（R2），以检验方程的拟合优度。其中，y 为零余子发芽率，x 为辐射剂量；y=50%时的x 值即为半致死剂量（LD50）；y＝40%时的x值为临界剂量（LD40）。据此，一元线性回归方程为y=?0.8776x+103.37；决定系数达到0.8008，差异极显著。当y=50 时，可得出x=60.8；当y=40时，可得出x=72.2。即在本研究条件下，淮山药品种桂淮5 号零余子诱变的适宜辐照剂量范围为60.8～72.2 Gy，辐射的半致死剂量为60.8 Gy、临界剂量为72.2 Gy（图1）。

2.3 各辐射剂量处理对淮山药零余子发芽势的影响

经辐射处理的淮山药零余子发芽明显滞后，而且这种趋势随着辐射剂量的增加而递增，其中60 Gy 和80 Gy 处理比对照出苗初始期推迟滞后10 d，100 Gy 的滞后15 d。从发芽势也可看出，随着剂量的递增，发芽势急剧下降（表3）。

由表3 可以看出，尽管40 Gy 辐射处理在15 d时发芽数比10 d 时增加103 个，达到高峰值，即发芽势为42.7%，低于CK 的64%，但其后5 d发芽数仍达到102 个，形成一个非常接近第一个高峰期的次高峰期，发芽率增至76.7%。因此，40 Gy 辐射处理对淮山药零余子发芽势的胁迫、损伤效应，不同于另外3 个剂量的处理，未表现为负效应。

2.4 不同辐射剂量处理对淮山药零余子既有芽生长发育成熟的影响

为了更直观地分清辐照处理对萌芽阶段及其后续苗期生长发育成熟阶段的影响，本研究引入了既有芽成活率的概念，即某处理收获时的实得株数/该处理的既有芽数100%=既有芽成活率。由表4 可以看出，40、60、80、100 Gy 处理的既有芽成活率分別为89.6%、77.1%、82%和75%，均明显低于对照，说明60Co-γ 辐射对淮山药零余子的损伤不仅作用于萌芽阶段，抑制萌发，形成弱苗，而且对整个生长期造成了延续影响，植株长势相对较差，对整个苗期生长均有明显负向效应。田间观察也发现黄化叶、白化叶现象以及畸形、嵌合体、丛生植株等。因此，与发芽率一样，各辐射处理的实收总株数、块茎数均比对照发生较大幅度减少，且随着剂量的加大，减少的幅度明显增大。但比较而言，辐照对既有芽成活率的不利效应要比其对发芽率的不利效应要小得多。比如，100 Gy 处理的发芽率仅为4.7%，而其既有芽的成活率为75%。因此，辐照主要是抑制了零余子发芽，对既有芽的生长也有影响，但要小得多（表4）。

2.5 不同剂量处理对淮山药M1 代结薯特性及块茎性状的影响

2.5.1 对块茎形状及重量的影响 与对照相比，不同辐射剂量处理的块茎长度、直径、重量均有所增加，并随着辐照剂量的增加表现先升后降再升的趋势。40、80、100 Gy 剂量处理的块茎长度、直径、重量均较CK 的增加，且均达到显著以上水平；60 Gy 处理比CK 的增加幅度较小，但除薯长外，薯茎、薯重也达到显著水平（表5）。40 Gy处理的薯长、薯径、薯重均比对照有较大幅度增加，分别增加了38.9%、31.3%、73.8%；而60 Gy处理比CK 的增加幅度小，是各辐射剂量对薯长、薯径、薯重影响效应最小的处理。60 Gy 处理的这种效应似乎间断了随着辐射剂量的提高薯长、薯径、薯重相应比CK 增加的趋势。以单薯重为例，40 Gy 处理的单薯重为0.73 kg，比对照增加了73.8%；60 Gy 处理的块茎重为0.59 kg，比对照增加了40.5%，尽管比对照仍明显增重，但没有持续40 Gy 处理的增幅；80 Gy 的块茎重为0.67kg，比对照增加了59.5%，持续了60 Gy 处理增长趋势，比60 Gy 处理的大，但仍然比40 Gy 处理的小。说明至少在数理统计上，40 Gy 辐照处理表现出的性状表征具有特殊性，与其他3 个处理表现不尽相同，是否在效应因果关系上有差别需要进一步研究加以厘清甄别。另外，100 Gy 处理的块茎重为1.8 kg，比对照增加了328.6%（图2）。该变异的原因和机理值得更深入的研究，是否遗传需要进一步开展多世代观察。

2.5.2 对发生双胞薯及次生芦头现象的效应 双胞率表示由一个淮山药零余子长成的单株有2 个或多个成薯的株数占该处理总株数的百分数。本试验的对照桂淮5 号为单胞品种，试验结果也均为一株结一个块茎，但经辐射的4 个处理均不同程度地出现了双胞结薯现象。同时，在一个单株中除正常结薯的芦头外，还出现了2 个甚至多个没有结成块茎的芦头，本文称之为次生芦头，以对应区别于正常结薯的芦头。次生芦头的出现同样随着剂量的增加而增加，但辐射剂量越高次生芦头成薯的概率越低。40 Gy 处理无次生芦头出现，有2 个分别出现结2 个块茎的单株，即双胞株，占该处理收获株数的0.8%；60 Gy 处理16株出现次生芦头，其中11 株为双胞株（含1 个3胞株），占该处理收获株数的8%，是双胞株率最高的处理；80 Gy 处理有13 株长有次生芦头，其中4 个双胞株，占5.6%；100 Gy 处理全部9 个单株均为长有次生芦头的单株，其中1 个为双胞株，占比为11.1%（表6）。

2.5.3 对块茎分枝特性的影响 淮山药品种桂淮5 号的块茎为长圆柱形，无分枝。块茎双（多）分枝率是指由一个芦头长成的块茎出现2 个（多个）分枝的块茎数占该处理总块茎数的百分数。在60 ～100 Gy 之间，随着辐射剂量增加，分枝的趋势愈明显。40 Gy 处理仅出现2 个分枝的块茎1个；60 Gy 处理出现3 个分枝的块茎2 个，4 个、6 个分枝的块茎各1 个；80 Gy 处理出现3 个分枝的块茎3 个，4 个分枝的块茎1 个；100 Gy 处理的单株块茎则全部发生了分枝，其中2 个分枝的3 个，3 个以上分枝的7 个，最多的1 个块茎分枝数达到10 个（表6、表7）。

3 讨论

3.1 淮山药品种桂淮5 号零余子60Co-γ 辐射诱变的半致死剂量和临界剂量

本研究经相关性分析得到零余子的发芽率与60Co-γ 辐射剂量之间的相关回归方程为： y=?0.8776x+103.37；决定系数为0.8008，达极显著差异。这说明在一定剂量范围内，淮山药品种桂淮5 号零余子的发芽率、发芽势与辐射剂量之间呈高度负相关，随着60Co-γ 辐射剂量的增加，淮山药零余子的发芽会被抑制和延迟。

桂淮5 号零余子60Co-γ 辐射的半致死剂量为60.8 Gy，临界剂量为72.2 Gy。因此，对淮山药品种桂淮5 号零余子进行诱变处理的适宜辐照剂量范围为60.8～72.2 Gy。不同植物、不同品种、相同品种的不同器官、相同器官的不同部位、不同生长时期，由于结构和生理生化特性等的差异，对60Co-γ 辐射的敏感性和耐受程度不同，需要通过试验才能确定合适的处理剂量。

本研究得到的淮山药桂淮5 号零余子的辐射半致死剂量与刘艳芝等[11]报道的结果差别较大。在该研究中， 嘉祥细毛长山药零余子LD₅₀=18 964.8 Rad ， 济宁米山药零余子LD₅₀=23 588.0 Rad ， 牛腿山药零余子LD₅₀=23 369.2 Rad，铁棍山药零余子LD₅₀=20 153.8 Rad（Gy 与Rad 的换算关系是1 Gy=100 Rad）[8]。据此，这些淮山药品种的LD50 为189.6～235.9 Gy，远大于桂淮5 号的60.8 Gy。这可能与所采用的辐射剂量率、淮山药品种及其生态类型等不同有关。

3.2 40 Gy 辐射处理对淮山药零余子M1 群体萌芽及生长发育可能具有促进作用

在有效辐射剂量的下限附近，即本试验中的40 Gy 处理，与对照相比，其淮山药零余子相对发芽率顯著上升，而且对M1 代块茎的长、径、重的增加效应也表现出较明显的生长促进效应，薯长、粗、重均有较大幅度增加，表明此辐射强度对淮山药零余子萌芽及生长发育有促进作用。这种正面效应具有实际应用价值，零余子可以作为繁殖材料，提高繁殖系数，在淮山药品种提纯复壮乃至大田生产中提供更高效的技术路径，值得进一步研究。

3.3 辐照处理诱导零余子M1 代双胞结薯、次生芦头、块茎丛生分枝的变异

本研究中，在有效辐射剂量范围内，辐射使淮山药M1 代产生不同程度的双胞结薯、次生芦头和块茎分枝现象。这些均应同属于植物学意义上的茎芽分生。尤其是在60 Gy 处理中获得了8.0%的双胞结薯率，这是一个特别值得关注的诱变效应。双胞结薯符合小型薯早熟密植丰产轻简化栽培的育种目标要求，能有效解决当前淮山药主推品种块茎过长、种收劳动力成本过高的难题。而且，覃维治等[14]研究表明，结薯数是影响淮山药产量的因素之一，对产量提高有一定的作用，在淮山药育种中，应选择结薯数适中的品种。

另外，在可耐受辐射剂量的上限附近，即本研究中的100 Gy 处理，零余子发芽率仅为4％，可被视为致死极限辐射剂量，却诱发了该处理全部块茎出现多个分枝甚至分枝丛生现象，薯形由长柱形变异为不规则块状，且其平均单薯重达到了1.80 kg。丛生芽变异在其他作物的诱变育种中也较常见，多被视为不良性状，没有选择意义。但对以块茎为经济产量的淮山药等作物来说，地下块茎分枝、丛生，长成块状块茎，在某种程度上，比如对提高产量而言，一旦这种变异是可遗传的，就可能成为具有应用价值的优良性状。张明玉等[15]就曾提出，淮山药生产应该走“应用块状品种，起垄轻简栽培”的发展方向。

3.4 从零余子辐射处理的M1 代可以选择获得具有明显变异的单株

本研究从零余子辐射处理的M1 代共筛选获得了18 个双胞结薯、11 个大型薯和1 个开雌花等表现差异明显的单株，这些变异单株形成的生理基础、诱变机理值得深入研究，其遗传性有待在M2 代等后继世代继续研究观察。