多花黄精根茎内生真菌的物种多样性研究

韩一人，刘玉军，陈 歆，郑先雨，胡江昕，陈名君*

多花黄精根茎内生真菌的物种多样性研究

韩一人1，刘玉军2，陈 歆1，郑先雨3，胡江昕1，陈名君1*

(1. 安徽农业大学安徽省微生物防治重点实验室，合肥 230036；2. 安徽省科学技术研究院，合肥 230031； 3. 安徽省口腔疾病研究中心实验室，合肥 230032)

多花黄精是一种著名的中药材，其药用部位（根茎）含有多种内生真菌，是新化合物、新药源和生防制剂的潜在资源。为研究黄山市祁门县多花黄精根茎内生真菌的物种多样性，为其开发利用提供种质资源，采用组织分离法分离培养多花黄精根茎内生真菌，通过经典形态分类学并结合rDNA ITS序列比对鉴定分离得到的真菌，并进行物种多样性分析。结果表明，从多花黄精根茎中共分离出182株内生真菌，经鉴定为2门、5纲、13目、28科、33属和49种，另外有4株未确定其分类地位。其中子囊菌门(Ascomycota)为优势门，分离频率为83.52％；粪壳菌纲(Sordariomycetes)为优势纲，分离频率为59.34％；肉座菌目(Hypocreales)为优势目，分离频率为46.70％；优势科是麦角菌科(Clavicipitaceae)，分离频率为33.52％；是优势属，分离频率为33.52％。物种多样性研究结果表明黄山市祁门县多花黄精根茎的内生真菌物种丰富，群落结构复杂，且春季的多花黄精根茎内生真菌的Shannon-Wiener指数、Pielou均匀度指数、Simpson优势度指数和丰富度指数均高于夏季。

多花黄精；内生真菌；鉴定；多样性

多花黄精（Hua, J. Bot. (Morot)）隶属于百合科（Liliaceae）黄精属（），是一种药食同源多年生草本植物[1]。广泛分布于皖西南各林地，其地下具横生根状茎，肉质肥大，属于“十大皖药”之一[2]。现代研究表明多花黄精富含多糖、甾体皂苷、黄酮、生物碱、木脂素、植物甾醇和多种氨基酸等有效化学成分[3]。药理研究发现，黄精具有抗氧化衰老[4]、降血糖[5]、调血脂[6]、抗癌排毒[7]、改善睡眠[8]、调节免疫[9]、增强记忆[10]等作用。多花黄精营养价值十分丰富，其在药膳、保健品、化妆品等方面都具有很高的开发价值，市场前景广阔[11]。

内生真菌指生活在健康组织和器官且不会引起宿主植物明显感染症状的一类微生物群，普遍存在于藻类、苔藓、蕨类、裸子植物和被子植物的组织和器官内部，并且内生真菌数量众多，种群结构多样[12-13]。这些真菌在漫长的进化中与宿主植物之间建立了特殊的关系，能显著影响植物体内代谢产物的形成，进而影响药用植物的质量与生长量[14]。在我国，传统中医药文化历史悠久，药用植物资源种类十分丰富，其中蕴含着丰富而独特的内生真菌资源。而内生真菌的研究对于保护野生与濒危药用植物、拓展药用资源、新药研发、生物防治等均有一定意义[15]。

黄精属植物作为重要的药用植物，其相关种的内生真菌研究陆续有报道。李艳玲等[16]从泰山黄精（Delar. Ex Redoute）的根、茎、叶组织块和果实中分离得到32株内生真菌，经分子生物学鉴定为7个属，其中镰刀菌属（）占比最高，达到31.3%。谭伟等[17]从滇黄精（Coll. et Hemsl）中共分离得到内生真菌37株，分为 4属7种，镰刀菌属也为优势属。蔡媛等[18]采用高通量测序对不同地区的黄精内生菌群落结构进行分析，得知黄精内生真菌分7门、27纲、70目、132科和187属。这表明黄精属药用植物内生真菌资源非常丰富，有待进一步挖掘。另外，采自不同产区或地区的同种植物的内生菌多样性也有所差异[19]。黄精属植物主要以根状茎为入药部位，且黄精根腐病是制约其产量和质量的重要因素，因此系统研究安徽祁门自然分布的多花黄精根茎内生真菌，对其物种多样性的评估、药用价值以及生物防治潜力的挖掘具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 样地设置和标本采集

调查样地位于安徽省黄山市祁门县新安镇仙寓山自然保护区（29°96' N，117°27' E）。该地属于亚热带季风温湿气候，光照充足，四季分明。年均气温15.6 ℃，年降水量1 600 mm以上。土壤主要为紫色页岩等风化而成的黄壤或红黄壤，含有较丰富的矿质元素。该地区植被类型为亚热带常绿阔叶天然林，自然环境优越，植被茂密，且多花黄精资源丰富。根据多花黄精自然分布特点，在海拔600 m左右采用随机采样法采集样品，于春季（3月）和夏季（8月）采集多花黄精根茎。将采集的样品放入自封袋内，并与冰袋一起装入泡沫盒子中，带回实验室后立即进行分离培养。

1.2 多花黄精内生真菌的分离及纯化

选取上述采集新鲜健康的多花黄精根茎，用无菌水和毛刷清洗，去除表面泥土污垢，再放入数控超声清洗器中清洗20 min，置于无菌滤纸上晾干。放入无菌台中进行表面消毒，首先用75%乙醇浸泡3 min，后用3%次氯酸钠浸泡2 min，再放入75%乙醇浸泡30 s，最后用无菌水冲洗3次，放置无菌滤纸上擦干根茎表面水分。用无菌刀片削去根茎表皮，将根茎组织切成5 mm × 5 mm的薄片，放置于PDA培养基（马铃薯200 g·L-1、葡萄糖20 g·L-1、琼脂20 g·L-1）上，每个平皿放置4个组织薄片，每样品重复3次，并以漂洗液涂布于 PDA培养基上作为对照，将其置于25 ℃（L/D 为 12 h/12 h）培养箱中培养。待培养基中组织块长出菌丝后，用无菌接种针将菌丝挑至新的PDA培养基中于25 ℃培养箱中培养。若有杂菌污染则将菌丝挑取一点转至新的PDA培养基继续培养，多次重复直至获得单一菌落。每天观察菌落形态特征，如菌落颜色、质地、分泌物等，并记录。

1.3 多花黄精内生真菌的鉴定

1.3.1 形态学鉴定 将分离纯化后的内生真菌接种于PDA培养基上，置于25 ℃恒温培养箱中培养。每日观察记录各菌株菌落形态、颜色、质地、有无色素等特征，并在光学显微镜下对菌丝、孢子和产孢结构进行观察，依据《真菌鉴定手册》[20]进行分类鉴定，并结合相关文献进行形态鉴定。

1.3.2 分子鉴定 将纯化后的菌株接种到铺有玻璃纸的PDA培养基上，置于25 ℃恒温培养箱中培养3 ～ 5 d，刮取菌丝0.10 ～ 0.15 g备用。采用改良的CTAB法对菌株基因组DNA进行抽提。

ITS-PCR扩增：PCR反应体系为25 μL，2×PlusMasterMix 12.5 μL，正反向引物（ITS4：5´-TCC TCCGCTTATTGATATGC-3´；ITS5：5´-GGAAGTAA AAGTCGTAACAAGG-3´）（0.01 mol·L-1）各1 μL，1.5 μL模板DNA和9 μL超纯水。PCR扩增程序：95 ℃预变性 3 min，95 ℃变性 15 s， 48 ℃退火15 s，72 ℃延伸 1 min，循环 34 次；循环结束后72 ℃延伸5 min。将PCR扩增的产物在1.0％琼脂糖凝胶上电泳分离，EB染色后于凝胶成像系统检测拍照并送至华大基因（北京）公司进行测序。测序结果使用Chromas软件校对。将ITS-rDNA序列提交到NCBI中的Nucleotide数据库中进行比对，选取相似度最高的序列作为参考。根据Landeweer等[21]认为通过ITS区域比对，序列相似性大于 99%，鉴别为相同种；序列相似性大于 95%且小于99%，鉴别为相同属；序列相似性小于95%，鉴别为相同科。

1.4 数据统计与分析

本研究采用分离率 (isolation rate，IR)[22]、分离频率（isolation frequency，IF）[23]以及微生物多样性指数来分析内生真菌在多花黄精根茎中的分布情况和种群结构。多样性指数包括香农指数[24](Shannon-Weiner diversity index，H)，指数的值越大，则多样性越高，种群的复杂程度也越高；均匀度指数[25]（Pielou's evenness index，E）表示某一群落或生境中全部物种个体数目的分配状况，可表示各物种个体数目分配的均匀程度；辛普森指数[26]（Simpson's diversity，D）是在群落的类群组成基础上进一步推算出来以表达群落组成状况的指标，优势度指数越大，表明生物群落内不同种类生物数量分布越不均匀，优势生物的生态功能越突出。为能全面评估样品中的物种丰富度，采用丰富度指数（Margalef's index，M）；为掌握群落间的相似程度，采用相似性指数[27]（Srenson's similarity coefficients，Cs）。具体公式如下：

=(―1)/log2

=2/(+)

式中，为某种属内生真菌菌株数目与全部菌株数的比值，为内生真菌的物种数，为菌株总数，是两种组织中具有的相同内生真菌种类数，是一个季节中内生真菌的种类数，是另一季节中内生真菌的种类数。

2 结果与分析

2.1 多花黄精内生真菌初步鉴定结果

本研究从多花黄精根茎共分离出内生真菌182株，总分离率为45.45%。根据菌株的形态学特征，如菌落形态、颜色、质地、有无色素等（图1），并用光学显微镜观察其菌丝显微特征、孢子形状大小、产孢结构等特征；结合ITS序列Blast比对结果（表1）进行内生真菌种类初步鉴定，将分离得到的内生真菌归类为2门、5纲、13目、27科、33属和49种。

A-a (HJ-102): Cladosporium allicinum;B-b (HJ-22): Cladosporium anthropophilum; C-c (HJ-164): Peniophora cinerea; D-d (HJ-121): Colletotrichum liriopes; E-e (HJ-101): Metapochonia bulbillosa; F-f (HJ-79): Schizophyllum commune. A-F: 菌落正面；a-f: 菌落背面。

Figure 1 Partial endophytic fungal morphology

表1 多花黄精内生真菌ITS序列比对结果

表2 多花黄精根茎内生真菌种群分布

续表2

表3 春夏季多花黄精根茎内生真菌多样性指数和相似性指数

2.2 多花黄精内生真菌的种群结构

从门水平上来看，分离得到的内生真菌有子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)，其中子囊菌门分离频率为83.52%，是优势门，而担子菌门分离频率为14.29%。从纲水平上看，粪壳菌纲(Sordariomycetes)为优势纲，分离频率为59.34%。其次座囊菌纲(Dothideomycetes)和伞菌纲(Agaricomycetes)分离频率分别为15.38%和14.29%，散囊菌纲(Eurotiomycetes)和锤舌菌纲(Leotiomycets)分别为5.49%和3.30%。

从目水平上看，肉座菌目(Hypocreales)为优势目，分离频率为46.70%；其次伞菌目(Agaricales)、格孢腔菌目(Pleosporales)、小丛壳目(Glomerellales)的分离频率较高，分别为10.44%、9.89%和8.79%。红菇目(Russulales)、多孔菌目(Polyporales)、葡萄座腔菌目(Botryosphaeriales)、Cladosporiales、散囊菌目(Eurotiales)、柔膜菌目(Helotiales)、粪壳菌目(Sordariales)、间座壳目(Diaporthales)和小囊菌目(Microascales)的分离频率依次为1.10%、2.75%、2.20%、3.30%、5.49%、3.30%、0.55%、2.20%和1.10%。

从科水平上看，优势科是麦角菌科(Clavicipitaceae)，分离频率为33.52%；其次裂褶菌科(Schizophyllaceae)、Phaeosphaeriaceae、赤壳科(Nectriaceae和小丛壳科(Glomerellaceae)的分离频率较高，依次为9.89%、7.14%、9.34%和7.69%，其余23科分离频率均低于4%。

从属水平上看，异普克尼亚属（）是优势属，分离频率为30.77%；其次裂褶菌属()、球腔菌属（）、镰刀菌属()和炭疽属()的分离频率较高，依次为9.89%、6.59%、8.24%和7.69%。其余28属的分离频率均低于4%。

从种水平上看，球芽异普克尼亚菌（）是优势种，分离频率为30.77%；其次裂褶菌()和尖孢镰刀菌()的分离频率较高，分别为9.89%和6.04%。其他种的分离频率不高且相差不大(表2)。

2.3 多花黄精根茎内生真菌春夏季物种多样性和相似性比较分析

通过比较分析可知，多花黄精根茎内生真菌在春季和夏季的分离率差别不大，春季和夏季的Shannon-Wiener指数()、Pielou 均匀度指数()、Simpson 优势度指数() 、丰富度指数（）的数值均较高，表明多花黄精根茎具有较高的内生真菌物种多样性，种群结构较复杂，且春季的各项指数均略高于夏季（表3）。两个季节共有的属有10个（表4），春季独有的属有13个，夏季独有的属有10个，相似度仅为0.46，表明春季与夏季的多花黄精根茎内生真菌种类差异较大。

表4 春夏季多花黄精内生真菌的种群数量和分离频率

3 讨论

安徽省黄山市祁门县仙寓山自然保护区内自然环境优越，植被茂密，蕴含丰富的生物资源。本研究以自然分布的多花黄精为研究对象，从其根茎中共分离得到2门、5纲、13目、28科、33属、49种和4株未知类群的内生真菌。其中子囊菌门为优势门，而担子菌门的分离频率较小，这与其相关种内生真菌分离结果相似[16]。属水平上，共获得33属，其中链格孢属、炭疽菌属、镰刀菌属和青霉属4个属在李艳玲等[16]泰山黄精根茎中内生真菌研究中也有报道。程子洋等[28]从黄山多花黄精根茎共分离出内生真菌21属，其中间座壳属、镰刀菌属、曲霉属、篮状菌属、青霉属、枝孢霉属、链格孢属、炭疽菌属、脉孢菌属和共10属在本次研究中也有分离到，说明这些类群是较稳定存在于多花黄精根茎中。这可能是植物内环境的微生物与植物长期协同进化，形成了一种稳定的互利共生关系[29]。

本研究分离得到的异普克尼亚属中的球芽异普克尼亚菌为优势种，分离频率为30.77%，其次是裂褶菌和尖孢镰刀菌。这一分离结果和李艳玲[16]和程子洋[28]等的研究结果差异较大。从其研究结果来看，分离出的黄精相关种的内生真菌优势种均属于镰刀菌，且并未分离到裂褶菌属和异普克尼亚属，可见黄精相关种的不同种群或者不同生态环境下其根茎内生真菌的种群分布有较大差异。从多样性指数结果来看，发现其种属分布多样，群落结构复杂，物种资源相当丰富，且在多花黄精营养生长期和生殖生长期的春季与夏季的内生真菌具有一定的特异性。曹益鸣等[30]曾对不同生长周期的茅苍术内生真菌的种类做过分析，发现苗期和花期时数量较多，果熟期和幼苗期较少，优势种群组成及数量在各个生长期也具有明显差异；李慧玲等[31]认为内生真菌物种分布及其种群组成可能与宿主差异、地点差异、季节的温度、降雨等特征有关。因此，作者认为多花黄精生长周期和生长季节变化是造成春季和夏季内生真菌差异的主要原因。本研究极大地丰富了多花黄精内生真菌的物种资源，为今后多花黄精内生真菌的药用价值和生物防治研究奠定了基础。由春季和夏季分离的内生真菌情况来看，多花黄精在冬季和秋季很可能也具有一定的独特内生真菌群落结构，由于受疫情因素的影响，本研究未采集冬季与秋季多花黄精根茎样品。今后的研究将进一步完善此方面，补充其物种多样性数据和菌种资源。

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Study on species diversity of endophytic fungi in rhizome of

HAN Yiren1, LIU Yujun2, CHEN Xin1, ZHENG Xianyu3, HU Jiangxin1, CHEN Mingjun1

(1. Anhui Provincial Key Laboratory of Microbial Control, Anhui Agricultural University, Hefei 230036; 2. Anhui Academy of Science and Technology, Hefei 230031; 3. Key Lab of Oral Diseases Research of Anhui Province, Hefei 230032)

is a famous Chinese herbal medicine, and its medicinal part - rhizome contains a variety of endophytic fungi, which is the potential resource for new compounds, new drug sources and biocontrol preparations. In this study, in order to study the species diversity of endophytic fungi in rhizome ofin Qimen County, Huangshan City to provide resources for its development and utilization, endophytic fungi from rhizome ofwere isolated and cultured by tissue isolation method and identified by classical classification combined with rDNA ITS sequences analysis and blast, and then their speices diversity was analyzed. As results, a total of 182 endophytic fungi were isolated from the rhizome of, which were identified as 2 phyla, 5 classes, 13 orders, 28 families, 33 genera and 49 species, and the other 4 strains had not been identified. Ascomycota was the dominant phylum, with a relative isolation frequency of 83.52%; Sordariomycetes was the dominant class, and the relative separation frequency was 59.34%; the relative isolation frequency of Hypocreales was 46.70%; the dominant family was Clavicipitaceae, with a relative separation frequency of 33.52%;was the dominant genus with a relative separation frequency of 33.52%. The results of speices diversity showed that the endophytic fungi were high species diversity and complex in community structure. The shannon-Wiener index, Pielou evenness index, Simpson dominance index and Margalef's index of endophytic fungi in spring were higher than those in summer.

; endophytic fungi; identification; diversity

10.13610/j.cnki.1672-352x.20230625.002

2023-06-26 15:15:27

S567.239; Q935

A

1672-352X (2023)03-0402-08

2022-06-30

2022年研究生双创培育项目，2021年贵池区科技计划项目（GCKJ202107）和2021年校级大学生创新创业训练计划项目（202110364214）共同资助。

韩一人，硕士研究生。E-mail：745049146@qq.com

通信作者:陈名君，博士，副教授。E-mail：mjchen@ahau.edu.cn

[URL] https://kns.cnki.net/kcms2/detail/34.1162.S.20230625.1450.004.html