小麦田日本看麦娘对唑啉草酯的抗药性机制研究

万永乐，戴玲玲，邢雨诚，孙倩倩，项 晶，毕亚玲*

小麦田日本看麦娘对唑啉草酯的抗药性机制研究

万永乐1，戴玲玲1，邢雨诚2，孙倩倩1，项 晶1，毕亚玲2*

(1. 安徽科技学院资源与环境学院，凤阳 233100；2. 安徽科技学院农学院，凤阳 233100)

为明确小麦田日本看麦娘对唑啉草酯的抗药性情况及潜在的抗药性机制，应用整株生物测定法测定了采自安徽省、江苏省多个日本看麦娘发生严重地区共19个日本看麦娘种群对唑啉草酯的抗药性水平，并选取6个高抗种群进行基因测序和GSTs活性测定，比较抗药性、敏感种群间的基因序列和GSTs活性差异，同时测定了AH-29对其他8种除草剂的敏感性。结果显示，9个日本看麦娘种群对唑啉草酯产生了高水平抗性，占被测总数的47.37%，抗性指数在12.70 ～ 38.77之间；种群AH-28、AH-29和JS-15的基因CT区域第1781位异亮氨酸（ATA）突变为亮氨酸（TTA），种群AH-36和JS-16第2027位色氨酸（TGG）突变为半胱氨酸（TGT），种群AH-34未发现突变；6个高抗种群体内GSTs活性经唑啉草酯处理后均明显高于同处理敏感种群AH-7；种群AH-29均对ACCase抑制剂炔草酯、烯草酮以及ALS抑制剂的甲基二磺隆和氟唑磺隆产生了高水平抗性，抗性指数分别为45.32、29.54、37.53和23.04；对三甲苯草酮产生了中水平抗性，对双草醚和啶磺草胺表现低抗，但对PSII抑制剂异丙隆较为敏感。研究表明，基因突变与GSTs活性增强是导致日本看麦娘种群对唑啉草酯产生抗药性的重要原因之一。

日本看麦娘；唑啉草酯；江淮地区；抗药性；交互抗性

日本看麦娘是我国麦田主要恶性禾本科杂草，具有抗逆性强、分蘖旺盛等竞争优势，在黄河及长江中下游流域等地的稻麦轮作区危害十分严重[1-2]。目前，生产上仍以化学防除为主[3]。乙酰辅酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase, ACCase）抑制剂类除草剂通过减少杂草体内ACCase参与的羧化反应，使其合成脂肪酸受阻而死亡，具有活性高、毒性低、选择性强等优点，被广泛用于麦田防除禾本科杂草[4-5]。但随着其长期、大量使用，加之作用靶标位点单一，导致多种禾本科杂草逐渐对其产生抗药性[6]。自1986年首次发现澳大利亚硬直黑麦草对该类除草剂产生抗药性以来，截至2022年5月，全球已有50种杂草对ACCase类除草剂产生了抗药性[7-8]。

现关于杂草抗ACCase类除草剂机理的研究多集中在靶标抗性（TSR）和非靶标抗性（NTSR）两方面[9-11]。靶标抗性主要是杂草体内酶基因发生突变而产生。目前已证实有7个基因突变位点氨基酸可以发生改变，分别为第1781、 1999、2027、2041、2078、2088和第2096位，且同一位点发生不同的氨基酸突变类型可导致对不同除草剂产生抗药性[12-13]。非靶标抗性主要是杂草代谢解毒机制通过增强GSTs和P450等代谢酶系的活动完成，使得杂草体内到达靶标酶的除草剂分子数量减少，从而减轻对杂草的伤害[14]。

唑啉草酯（pinoxaden）是先正达公司研发的一种新苯基吡唑啉（phenylpyrazoline, PPZ）类除草剂，因其作用靶标既不同于ALS类除草剂，虽同为ACCase抑制剂类除草剂，但作用位点不同于芳氧苯氧基丙酸酯类（aryloxyphenoxypropionates, APP）和环己烯酮类（cyclohexanediones, CHD）除草剂，被广泛用于小麦田中防除已产生抗药性的禾本科杂草[15-16]。但近年来，本课题组于田间杂草调查时发现，江淮部分地区唑啉草酯已不能对日本看麦娘进行有效防除，可能与其对唑啉草酯产生抗药性有关。目前，毕亚玲[17]、李蓉荣[18]等曾有关于对日本看麦娘对唑啉草酯产生交互抗性的报道，而其具体产生抗药性的机制还未见阐述。为此，本研究在江淮地区日本看麦娘发生严重的小麦田采集部分日本看麦娘种群，明确其对唑啉草酯的抗药性水平、比较抗药性与敏感种群的基因序列和GSTs酶活性差异，同时测定了其对不同类型除草剂的抗药性情况，旨在为小麦田抗药性日本看麦娘综合治理及除草剂科学合理施用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

日本看麦娘种子：2019年在江淮不同区域小麦田采集19个日本看麦娘种群；敏感种群AH-7为实验室已知的日本看麦娘种群[17]，采集自安徽省滁州市凤阳县非耕地，该地块从未使用过除草剂。ACCase抑制剂用药背景等具体信息详见表1，供试除草剂及剂型见表2。

表1 日本看麦娘各种群种子采集地点

试剂和仪器：Tris-HCl，上海麦克林生化科技有限公司；乙二胺四乙酸二钠（ethylenediamine- tetraacetic acid disodium salt, EDTA-2Na）和十六烷基三甲基溴化铵（hexadecyl trimethyl ammonium Bromide, CTAB），国药集团化学试剂有限公司；聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone, PVP），上海晶纯试剂有限公司；还原型谷胱甘肽（GSH），上海蓝季试剂有限公司；2, 4-二硝基氯苯（CDNB），上海浩然生物技术有限公司；SHP-150生化培养箱，上海森信实验仪器有限公司；HCL-2000行走式喷雾塔，昆山恒创力科技有限公司；TP-96G PCR扩增仪，德国耶拿分析仪器股份公司；GTR10-2高速冷冻离心机，日立（中国）有限公司；JY600E电泳仪，北京君意东方电泳设备有限公司。

表2 供试除草剂及施药剂量

注:加下划线的数字表示该药剂的田间推荐剂量。

1.2 试验方法

1.2.1 抗药性水平测定 采用整株水平生物测定法，参照《农药室内生物测定试验准则》GB NY/T 1155.4—2006进行[19]。分别选取足量、饱满度相对一致的日本看麦娘种子，放在铺有湿润滤纸的培养皿中，置于生化培养箱内（光照（L/D）=12 h/12 h；温度：25 ℃/15 ℃）催芽，待多数试材露白后，每盆固定15粒播种到装有4/5体积基质的塑料盆中（直径12 cm，高10 cm），覆土0.5 ～ 1.0 cm。在温室内（温度10 ～ 22 ℃、相对湿度55% ～ 70%）进行培养，采用盆底渗吸的方式使土壤保持湿润。待日本看麦娘一叶一心期，每盆间苗至10株。

供试剂量参照预试验结果，按等比比例设计浓度，具体剂量见表2。药剂配制根据浓度设定，用清水定容配制成高浓度母液，使用母液稀释梯度法稀释至所需浓度，各种群均单独设置空白对照，喷施等量清水，每处理设4次重复。待日本看麦娘长至三叶一心，使用HCL-2000型号行走式喷雾塔均匀喷雾，扇形喷头距叶片最高点50 cm，喷液压力275 kPa，喷雾量450 L·hm-2，喷药后继续将幼苗放于温室培养。药后21 d，剪取植株地上部分置于80 ℃烘箱中烘至重量不再变化，称取干重并计算干重抑制率，干重抑制率/%=（对照干草重﹣处理干草重）/对照干草重×100。

1.2.2 抗药性、敏感日本看麦娘种群基因检测 依据抗药性水平测定结果，选取6个高抗种群（AH-28、AH-29、AH-34、AH-36、JS-15和JS-16）和1个敏感种群（AH-7）进行基因检测。日本看麦娘培养和施药方法同1.2.1。待日本看麦娘长至三叶一心时，采用CTAB法[20]对各种群幼嫩叶片进行DNA提取。由已知的日本看麦娘基因序列（JQ068820.1）设计引物（-F: 5'-TTTC CCAGCGGCAGACAGAT-3'，-R: 5'-TCCCTGG AGTCTTGCTTTCA-3'）进行PCR扩增。反应体系共25 μL，包括：9.5 μL的ddH2O，12.5 μL 2 ×MasterMix，1 μL基因组DNA，10 μmol·L-1的前引物和后引物各1 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸2 min，34个循环；72 ℃终延伸10 min。回收PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，将含有目的条带的凝胶送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。参照大穗看麦娘的氨基酸序列全长(AJ310767)，使用DNAMAN 5.2.2软件比对测序结果的碱基差异。

1.2.3 GSTs活性测定 为进一步明确唑啉草酯对日本看麦娘体内GSTs活性的影响，供试种群同1.2.2，试验方法同1.2.1。唑啉草酯施药量为45 g (a.i.)·hm-2，空白对照喷施等量清水，设4次重复。分别于药后0、1、3、5、7、9和12 d剪取各种群地上部分幼嫩组织，并放入﹣80 ℃冰箱保存备用。

GSTs粗酶液提取：切取0.5 g叶片并加入液氮进行研磨，待叶片组织成粉状后加入8 mL提取液继续研磨，提取液主要成分有0.1 mol·L-1Tris-HCl、5% PVP（）和25 mmol·L-1还原型GSH，pH值为8.0。研磨完成后，1 690×g离心10 min，取上清液。

GSTs活性测定：根据毕亚玲[21]等方法，取0.1 mL粗酶液和3 mL 0.1 mol·L-1Tris-HCl缓冲液至具塞管中水浴保温10 min，温度为25 ℃，再加入0.1 mL 13 mmol·L-1的CDNB测定液反应10 min，测量340 nm处的吸光度值，计算GSTs活性。GSTs活性[nmol·（min-1·mg-1）] = 吸光度值×1 000/（粗酶液蛋白质浓度×9.5）。通过处理组GSTs活性与同日对照组GSTs活性的比值得出GSTs相对活性。

1.2.4 日本看麦娘对其他除草剂的敏感性测定 依据抗药性水平测定结果，选取抗药性最高种群AH-29，按照1.2.1所述方法，分别测定其与敏感种群AH-7对8种除草剂的敏感性，具体施药剂量见表2。

1.3 数据处理

使用Origin 2018对日本看麦娘GSTs相对活性进行比较，DPS 7.05软件进行数据分析，以日本看麦娘干重抑制率几率值（）与施药量对数值（）建立回归方程（= a + b），并计算各药剂对各种群的有效中量（GR50）和95%置信限。抗性指数（resistance index，）= 抗药性种群GR50/敏感种群GR50。分级标准如下，敏感，＜2；低水平抗性，2≤＜5；中水平抗性，5≤＜10；高水平抗性，≥10.00[22]。

2 结果与分析

2.1 不同日本看麦娘种群对唑啉草酯抗药性水平

供试20个日本看麦娘种群中，除已知敏感种群AH-7外，9个种群对唑啉草酯表现出高水平抗性，占种群总数的47.37%，GR50在100.24 ～ 305.88 g (a.i.) ·hm-2之间，与敏感种群相比，抗性指数在12.70 ～ 38.77之间。剩余中抗种群为4个，低抗种群为1个，5个种群仍对唑啉草酯表现敏感（表3）。

M：DNA Marker DL2000。

Figure 1 Amplification of fragments ofgenes

表3 不同日本看麦娘种群对唑啉草酯的抗药性水平

2.2 抗药性、敏感日本看麦娘种群ACCase基因差异

引物扩增区域包含已证实的7个氨基酸碱基突变位点，基因扩增序列长度为1 437 bp，序列比对结果显示种群AH-7、AH-28、AH-29、AH-34、AH-36、JS-15和JS-16的基因扩增片段与GenBank登录的质体型基因（JQ068820.1）的同源性分别为99.83%、99.71%、99.65%、99.70%、99.85%、99.61%、99.78%和99.89%，表明扩增序列为目标序列（图1）。

图2 唑啉草酯对抗药性和敏感日本看麦娘种群GSTs相对活性的影响

Figure 2 Effects of pinoxaden on relative GSTs activities of the resistant and susceptible populations of

目标序列与大穗看麦娘对应序列分析结果表明，种群AH-28、AH-29和JS-15第1781位碱基由ATA突变为TTA，导致异亮氨酸突变为亮氨酸；种群AH-36和JS-16第2027位碱基由TGG突变为TGT，导致色氨酸突变为半胱氨酸；种群AH-34未发现突变（表4）。

2.3 唑啉草酯对日本看麦娘GSTs活性的影响

供试抗药性种群经唑啉草酯药剂处理后体内的GSTs活性迅速上升，均高于敏感种群AH-7。药后5 ～ 7 d，抗药性种群体内的GSTs活性上升至最大值，表明此时各种群体内对唑啉草酯的代谢反应水平最高；然后GSTs活性逐渐降低，分析可能是其对唑啉草酯代谢趋于完成。而敏感种群AH-7在活性下降期间伴随着药效症状的显现，最终植株死亡，表明抗药性种群体内GSTs对唑啉草酯具有更强的代谢能力（图2）。

2.4 抗唑啉草酯日本看麦娘种群对其他除草剂的敏感性

测定结果显示，相较于敏感种群AH-7，AH-29对ACCase抑制剂炔草酯、烯草酮，ALS抑制剂甲基二磺隆和氟唑磺隆产生了高水平抗性，抗性指数分别为45.32、29.54、37.53和23.04；并对三甲苯草酮、双草醚和啶磺草胺产生了中水平或低水平抗性，抗性水平分别为6.47、3.10和4.08，但对PSII抑制剂异丙隆依旧敏感（1.86），仍可使用该药剂对日本看麦娘进行防除（表5）。

表4 不同抗药性日本看麦娘种群ACCase基因序列比较

种群各氨基酸的位置和碱基及相应氨基酸序列 2021202220232024202520262027202820292030 大穗看麦娘CTGTTCATACTTGCTAACTGGAGAGGCTTC LeuPheIleLeuAlaAsnTrpArgGlyPhe AH-7CTGTTCATACTTGCTAACTGGAGAGGCTTC LeuPheIleLeuAlaAsnTrpArgGlyPhe AH-36CTGTTCATACTTGCTAACTGTAGAGGCTTC LeuPheIleLeuAlaAsnCysArgGlyPhe JS-16CTGTTCATACTTGCTAACTGTAGAGGCTTC LeuPheIleLeuAlaAsnCysArgGlyPhe

注:下划线表示该位点发生氨基酸突变。

表5 抗药性日本看麦娘种群对8种除草剂的敏感性

3 讨论与结论

日本看麦娘对唑啉草酯的抗药性产生可能与其用药历史有关。有研究表明，ACCase类除草剂连续使用6 ～ 10年就能导致杂草对其产生抗药性[23]。目前，国内已报道有多种杂草对该类除草剂产生了抗药性，如看麦娘[24]、耿氏硬草[25]等，其所在地块已连续多次使用ACCase抑制剂防除田间杂草，表明连续使用单一作用机制的除草剂是杂草抗药性产生的重要原因之一。自2010年唑啉草酯在我国正式获得登记后，其在田间的应用已超过10年，近年来，唑啉草酯对安徽、江苏等小麦主产区日本看麦娘的防治效果逐渐下降，本研究所测的19个日本看麦娘种群中，已有9个种群对唑啉草酯产生了高水平抗性，这一事态应引起重视。

本研究中种群AH-28、AH-29和JS-15发生了Ile-1781-Leu的氨基酸突变形式，种群AH-36和JS-16发生了Trp-2027-Cys突变，该2种突变形式已在多种杂草中被发现，Yu等[26]报道Ile-1781-Leu突变是导致野燕麦对精噁唑禾草灵产生抗药性的重要靶标分子机制。Délye等[27]在抗ACCase类除草剂的大穗看麦娘体内发现了Trp-2027- Cys突变。表明基因第1781与2027位突变同样可能是导致上述日本看麦娘种群对唑啉草酯表现为抗药性的重要原因之一。

代谢酶GSTs是能够催化谷胱甘肽与其他化合物相连接从而使植物体达到脱毒的一组同工酶，其介导的代谢活性增强是造成杂草产生抗药性的非靶标抗性机理方面的一种重要原因[15]。韩瑞娟等[28]报道，抗药性日本看麦娘种群体内GSTs代谢反应水平经高效氟吡甲禾灵处理后明显高于同处理敏感种群。本研究中，各抗药性种群经唑啉草酯药剂处理后体内的GSTs活性迅速上升，均高于敏感种群AH-7，其中，种群AH-34靶标位点并未发现突变，但抗药性水平达AH-7的23.16倍，表明抗药性与敏感种群之间GSTs对唑啉草酯解毒能力的差异也可能是导致其表现为抗药性的原因之一。然而本研究仅对抗药性与敏感种群体内的GSTs活性进行了测定与比较，对于非靶标抗性方面的研究还需进一步深入，如P450氧化酶活性的影响等。

据报道，通常杂草体内基因第1999、2027、2041和第2096位氨基酸发生突变仅会导致其对ACCase类除草剂中的APP类抑制剂产生抗药性，而第1781、2078和第2088位氨基酸突变则会对不同的ACCase类抑制剂产生抗药性[12, 29]。本研究中，基因发生Ile-1781-Leu突变的日本看麦娘种群AH-29对ACCase抑制剂炔草酯、烯草酮和三甲苯草酮均产生了高水平或中水平的交互抗性，其中炔草酯属APP类抑制剂，烯草酮和三甲苯草酮属CHD类抑制剂，此结果与前人研究一致。此外，AH-29对ALS抑制剂双草醚、啶磺草胺、甲基二磺隆和氟唑磺隆也均产生了不同水平的抗药性，其中对甲基二磺隆和氟唑磺隆表现高抗，但AH-29对PSII抑制剂异丙隆仍较敏感。此结果可为日本看麦娘等禾本科杂草的抗性治理，指导科学合理使用除草剂提供理论依据，并在农业生产实践中结合深耕、轮作等农业措施，以延缓杂草抗药性的进一步发展。

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Study on resistance mechanism ofto pinoxaden in wheat field

WAN Yongle1, DAI Lingling1, XING Yucheng2, SUN Qianqian1, XIANG Jing1, BI Yaling2

(1. College of Resource and Environment, Anhui Science and Technology University, Fengyang 233100; 2. College of Agriculture, Anhui Science and Technology University, Fengyang 233100)

In order to clarify the resistance level and possible resistance mechanism ofto pinoxaden in wheat field, the resistance level of 19populations in Anhui Province and Jiangsu Province to pinoxaden were determined by whole-plant bioassay. Thegene sequencing and GSTs activity determination were performed on the six populations with the highest resistance to compare the difference in gene sequences and GSTs activity between resistant and sensitive populations, and the sensitivity of AH-29 to other eight herbicides was also determined. The results showed that the ninepopulations had high level resistance to pinoxaden, accounting for 47.37% of the total tested population, and the resistance indices ranged from 12.70 to 38.77. Isoleucine (ATA) was mutated to leucine (TTA) at position 1781 ofgene CT region in AH-28, AH-29 and JS-15, and tryptophan (TGG) to cysteine (TGT) at position 2027 ofgene in AH-36 and JS-16. No mutation was found in population AH-34. The GSTs activity in six resistant populations was higher than that in susceptible population AH-7 after treated with pinoxaden. Population AH-29 showed high level of resistance to the acetyl-CoA carboxylase (ACCase) inhibitor clodinafop-propargyl, clethodim, and acetolactate synthase (ALS) inhibitor mesosulfuron-methyl and flucarbazone-sodium, withvalue of 45.32, 29.54, 37.53 and 23.04, respectively. In addition, AH-29 showed moderate resistance to tralkoxydim, low resistance to bispyribac-sodium and pyroxsulam, but it was sensitive to photosynthetic II (PSII) inhibitor isoproturon. The increases ofgene mutations and the GSTs activity were very likely the reasons resulting in pinoxaden resistance ofpopulations.

; pinoxaden; Jianghuai region; resistance; cross-resistance

10.13610/j.cnki.1672-352x.20230625.023

2023-06-26 15:24:51

S481.4; S482.4

A

1672-352X (2023)03-0416-07

2022-07-29

国家发展改革委藏粮于地藏粮于技专项（发改投资[2021]430号），2022年度安徽省科技重大专项（202203a06020016）和农业农村部2022年农产品质量安全监管专项（农药）（15227023）共同资助。

万永乐，硕士研究生。E-mail：Wyl171@163.com

通信作者:毕亚玲，博士，教授。E-mail：byl-211@163.com

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