小立碗藓PpCAD4基因敲除载体的构建及功能研究

田 旭，闫慧清，刘 露，谢 丽，成 亮，姜 山

小立碗藓基因敲除载体的构建及功能研究

田 旭，闫慧清，刘 露，谢 丽，成 亮，姜 山*

(贵州师范大学生命科学学院，贵阳 550025)

木质素是植物抵御外界环境的重要成分，肉桂醇脱氢酶（cinnamic alcohol dehydrogenase，CAD）是木质素合成途径中的关键酶和限速酶之一。前期数据表明，在灰霉菌侵染下，基因上调表达，但功能尚未明确。本次研究利用同源重组原理构建-PTN182-敲除载体，从而破坏PpCAD4的alcohol dehydrogenase GroES-like domain（ADH_N）和zinc-binding dehydrogenase（ADH_zinc_N）结构域。利用PGE 6000介导小立碗藓原生质体转化，筛选并鉴定得到敲除突变体植株。qRT-PCR表明，敲除型植株中的表达量相对野生型减少了84%。通过对配子体的形态观察发现，突变株通过增加配子体中拟叶的数量，使得植株生物量增加，这表明在早期陆生植物的生长发育中起着重要作用。用灰霉菌侵染小立碗藓发现，0.5 d后野生型配子体菌丝入侵率为15%，菌丝入侵率为40%。侵染1 d后，配子体菌丝侵入率是野生型的2倍。表明能够增加小立碗藓对真菌病原菌的抗性。

木质素；肉桂醇脱氢酶；小立碗藓；；基因敲除；灰霉菌

木质素(Lignin)是一种复杂的酚类聚合物，是植物细胞壁的重要组成，是植物体中仅次于纤维素的一种重要大分子有机物质[1]。木质素的出现被认为在植物从水生环境过渡到陆地生活中起着重要的进化适应性作用，赋予早期维管束植物物理支撑，使其直立，并通过疏导组织实现水和溶质的长距离运输[2-3]。同时，木质素还可抵御生物病原菌入侵[4]。非维管束植物小立碗藓（）属于葫芦藓目（Funariales）葫芦藓科（Funariaceae），是高等植物中低等类群，是植物从水生向陆生过渡类群[5]。早期研究者认为小立碗藓不合成木质素，但是合成木酯素或类木质素[6]。小立碗藓具有合成木质素的全套基因，且本实验前期研究发现受病原菌胁迫时细胞壁会形成保守的乳突结构抵御入侵[7]。

肉桂醇脱氢酶（cinnamic alcohol dehydrogenase，CAD）是木质素合成途径中关键酶之一，是木质素合成途径的终反应，它催化合成木质素单体[8]。研究结果证实，CAD是含有锌蛋白的二聚体酶类，主要包含ADH_N (PF08240)和ADH_zinc_N (PF00107)两个保守结构域[9]。CAD几乎存在于所有植物中，并由多个基因和基因家族编码[10]。在拟南芥()中鉴别出9个同源物[11]，且基因的功能都不一致，仅生成G-木质素和生成S-木质素[12]。Xu等在小立碗藓中鉴别出4个基因，命名为、、和[13]。

灰葡萄孢（）又名灰霉菌，是一类重要的植物病原真菌[14]。有研究表明，小立碗藓被真菌病原菌感染后，组织会出现软腐、配子体褐变、原生质体萎缩、叶绿体解体、细胞壁酚类物质增加等现象[15]。拟南芥感染灰霉菌后症状首先出现在受感染的器官上，表现为局部病变，随后扩散至花、叶和果实，最终导致器官塌陷并从植物上脱落[16]。

本实验室构建了敲除载体和过表达载体，将其转化至小立碗藓中进行观察，发现敲除植株和过表达植株的配子体与野生型在形态上并没有太大的差异[17]。转录组数据表明，在灰霉菌侵染下基因均出现上调表达，其中基因显著上调[18]。对小立碗藓基因与其他物种的基因进化分析发现：和亲缘关系较近，和单独分枝[19]。独特的进化关系可能具有其他生理生化功能。本研究通过构建敲除载体获得突变株，为今后研究基因在早期陆生植物小立碗藓中的功能提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

所用材料小立碗藓和载体构建的PTN182载体均由由首都师范大学提供何奕騉教授赠送；DH5α感受态细胞由本实验室制备；灰霉菌c023菌株由华东师范大学许玲教授提供。DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒、限制性核酸内切酶Ⅰ、Ⅰ、Ⅰ、Ⅰ、PremixTM、T4-DNA连接酶、氨苄青霉素（Amp）、2 000 bp DNA Marker和15 000 bp DNA Marker均购于TaKaRa。Plasmid Mini Kit I试剂盒购于OMEGA biotek，卡那霉素购于美国Sigma公司，培养大肠杆菌试剂购于英国OXOID公司。引物的合成和序列测定工作，均委托上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.2 构建PpCAD4敲除载体

1.2.1上、下游臂的获取 在NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上检索基因登录号（XM_024537924.1），下载基因全长，将的DNA序列3 900 bp分成上游臂（, 721 bp）和下游臂（, 757 bp）两段分别设计引物。引物委托上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列如表1所示。以提取的小立碗藓DNA为模板，分别使用上游臂和下游臂的引物进行PCR扩增获取上下游臂目的片段。PCR反应体系为：正向引物和反向引物各1 μL，小立碗藓总DNA 3 μL，PremixTM酶25 μL，ddH2O补齐至50 μL。PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，64 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，32个循环，72 ℃连接5 min，4 ℃保存50 min。将PCR扩增得到的上、下游片段用1 %的琼脂糖回收目的片段后保存于﹣20 ℃冰箱。

表1 PpCAD4上、下游片段扩增的引物序列

注：表中划横线部分为所添加的酶切位点。

1.2.2PTN182载体构建 用限制性核酸内切酶（Ⅰ和Ⅰ）在37 ℃水浴锅中酶切PTN182质粒25 min。将胶回收的上游臂片段和酶切后的PTN182质粒避光16 ℃连接过夜，将连接液转化至大肠杆菌感受态细胞保存。提取PTN182-上游臂质粒，将含上游臂的PTN182质粒用限制性核酸内切酶（Ⅰ、Ⅰ）酶切，用于连接下游臂，方法同上游臂。构建好的-PTN182-质粒送往上海生工生物工程股份有限公司完成测序。

1.3 PEG介导的原生质体转化及筛选

1.3.1 小立碗藓原生质体的制备 取培养15 d的小立碗藓新鲜材料研磨至匀浆，均匀地铺在有玻璃纸的BCDATG培养基上培养7 d。将研磨2次的原丝体为材料加入到1%的崩溃酶中，避光轻摇0.5 h制备原生质体。用8% D-甘露醇洗涤原生质体2次，离心。300 μL MMM溶液重悬沉淀。取10 μL原生质体溶液，计算原生质体浓度，用MMM溶液调整原生质体浓度至1.6×106个待用。

1.3.2 PEG介导外源基因的转化和鉴定 以-PTN182-质粒为模板，用限制性核酸内切酶Ⅰ、Ⅰ酶切后胶回收，加入30 μL胶回收产物至原生质体溶液中，加入等体积的PEGT，45 ℃热激5 min。室温摇1 h, 1 500 r·min-1, 共3 min，收集原生质体沉淀。用8 mL 45℃预热的PRM/T重悬沉淀，均匀地铺在PRM/B培养基中，继续培养2周。用25 μg·mL-1G418进行第1次筛选，50 μg·mL-1G418第2次筛选。最终对存活植株进行分子鉴定，引物序列如表2所示。

表2 PpCAD4敲除后分子鉴定的引物序列

表3 qRT-PCR特异性引物

1.4 敲除突变体和野生型的qRT-PCR分析

在预冷的研钵中加入1 mL Trizol试剂，再放入180 mg新鲜小立碗藓，液氮研磨至粉末泛白。加入250 μL三氯甲烷后静置4 min，13 000 r·min-1，5 min，4 ℃离心，收集上清，再在上清中加200 μL异丙醇，快速混匀后静置5 min，13 000 r·min-1，8 min，4 ℃离心弃上清；加2 mL 75%的乙醇，12 000 r·min-1，5 min，4 ℃离心弃上清。洗涤RNA 2次，加20 μL无核酸水溶解RNA[16]。将获得的RNA反转录成cDNA，保存于﹣20 ℃冰箱待用。以为内参基因引物，引物为基因引物，引物设计如表3所示。进行实时荧光定量PCR，条件为：95 ℃、5 s，55 ℃、15 s，共40个循环。相对表达量的计算用公式2-△△Ct法[20]。

1.5 灰霉菌侵染小立碗藓

将培养10 d的灰霉菌用无菌水洗涤3次纱布过滤收集滤液，4 000 r·min-1，离心10 min。加入少量无菌水重悬孢子，取10 μL于血球计数板上计数。用POB培养基将灰霉菌孢子浓度稀释为5×105spore·mL-1备用。将生长25 d的小立碗藓转移至有少量无菌水的蛭石中，均匀地喷洒灰霉菌孢子悬液，以POB培养基为对照，收集材料。用台盼兰对材料进行染色，制成装片，于光学显微镜下计算菌丝侵入率。侵入菌丝率= 细胞中菌丝入侵的细胞数/100[21]。

2 结果与分析

2.1 PpCAD4基因敲除载体的构建

利用SMART在线工具分析，发现基因编码425个氨基酸；第78个氨基酸和第212个氨基酸是保守结构域ADH_N，第254到第385个氨基酸是ADH_zinc_N。所敲除的基因破坏了基因保守结构域（图1A）。

以小立碗藓基因组DNA为模板（图1B），通过PCR反应扩增和基因片段，用0.7%琼脂糖凝胶电泳检测。结果(图1C)显示，除空白对照外，其余两条PCR扩增的条带低于1 000 bp，与上述基因片段一致。经双酶切后将其连接在PTN182载体上，然后挑取单个菌落进行菌液PCR验证。结果（图1D）显示，除空白对照外，其余PCR扩增的条带与基因片段一致。用Ⅰ和Ⅰ进行酶切后（图1E），除泳道1为PTN182载体外，泳道2为1条5 000 bp的载体片段和1条757 bp的基因片段，后经测序验证得到-PTN182载体；再将PCR扩增得到的下游臂片段连接到-PTN182载体上，用Ⅰ和Ⅰ酶切后得到与载体一致的片段和与下游臂一致的片段（泳道3）。测序验证确定-PTN182-载体构建成功。

2.2 原生质体的制备及敲除植株鉴定

在1%的崩溃酶下制备小立碗藓原生质体，取10 µL于血球计数板下观察。结果（图2A）所示，完整的小立碗藓原生质体呈圆形或近圆形。II基因在小立碗藓植株中表现为G418抗性，转化原生质体在含 G418培养基上进行两次抗性筛选（图2B）。设计引物Q1、Q2和Q3进行分子鉴定（图2C），Q1正向引物设计在上游臂外围，反向引物设计在替换基因II上该引物扩增片段约含1 040个碱基对；Q2正向引物设计在替换基因II上，反向引物设计在下游臂上该引物扩增片段约含527个碱基对；Q3正向引物设计在上游臂外围，反向引物设计在下游臂外围该引物在突变株中扩增片段约含4 300个碱基对。3对引物设计用于确定敲除植株。经过PCR验证得到的结果(图2D)表明，Q1和Q2 2对引物在泳道5扩增片段与引物Q1设计扩增1 040 bp一致，泳道6扩增片段与引物Q2设计扩增527 bp一致。表明II基因已替换掉的部分序列。Q3引物未扩增出与预期一致的片段。

A：PpCAD4结构预测；B：小立碗藓基因组DNA提取（lane1和lane2是小立碗藓基因组DNA）； C：PCR扩增PpCAD4的上游片段和下游片段（lane1是阴性对照；lane2是扩增PpCAD4.1片段；lane3是扩增PpCAD4.2片段）；D：PpCAD4.1-PTN182- PpCAD4.2菌液PCR验证（lane1为阴性对照；lane2和lane3是PpCAD4.1菌液PCR；lane4和lane5是PpCAD4.2菌液PCR）；E：PpCAD4.1-PTN182- PpCAD4.2质粒酶切验证（lane1是原始的PTN182质粒，lane2是Kpn Ⅰ和SaⅠ Ⅰ双酶切的质粒，lane3是Sph Ⅰ和Not Ⅰ双酶切的质粒）；M：Marker =15 000 bp。

Figure 1 Electrophoretogram of the predictedstructure and the construction ofknockoutPTN182vector

A：原生质体形态（黑色箭头表示完整的原生质体），Bar =10 µm；B：G418筛选植株， Bar = 3 mm；C：3条引物设计区域分布；D：敲除植株分子鉴定(lane1、lane2是Q1、Q2引物阴性对照，lane3和lane4野生型植株，lane5和lane6突变植株)；M：Marker 5 000 bp。

Figure 2 The screening and identification of knockoutgametocyte

A：野生型配子体和突变型配子体表型，Bar =1 mm；B：PpCAD4的转录水平表达量；C：野生型与突变型的生物量。

Figure 3 The observation of wild type and-knockout plants

2.3 野生型和PpCAD4型基因表达和形态观察

挑取型单个配子体与WT型植株在解剖镜下进行观察，拟叶对称排列，叶片呈卵形，排列疏松。拟叶相比于WT型片叶的数量更多，叶片排列更为紧密（图3A）。检测基因的表达量发现，小立碗藓野生型的表达量是突变株的6.25倍，表明了该基因被破坏后降低了基因的表达量（图3B）。统计2种株型的生物量，发现突变株的鲜重高于野生型（图3C）。因此，可看出配子体的叶片数量增多，叶片分布更为紧凑，植株生物量增加。

2.4 灰霉菌侵染野生植株与突变植株

通过喷洒浓度为5×105spore·mL-1灰霉菌孢子悬液，在光学显微镜下观察灰霉菌感染小立碗鲜野生型与突变型的变化。计算菌丝侵入率发现，随着感染时间的增加，两种株型植株的茎与叶上的菌斑逐渐增多，表现为红褐色。但接种后的第2天，观察到的整个配子体均被菌丝覆盖，而野生型则没有明显菌丝存在(图4A)；台盼兰可通过死细胞的细胞膜，使死细胞中DNA与菌丝呈蓝色或黄褐色，通过统计视野内100个细胞的死亡数目来推算侵入菌丝率，得出细胞内菌丝入侵的数量随着入侵的时间的延长而逐渐增加（图4B），且敲除基因的突变株灰霉菌入侵的细胞数高于野生型。在接种灰霉菌4 h后菌丝开始入侵，接种0.5 d后中大量细胞被菌丝入侵，其侵染率高达40%；而野生型植株侵染率只有15%。接种灰霉菌1 d后，植株的茎和叶均出现褐化，野生型的叶片开始褐化。在接种1 d后发现大量细胞有菌丝入侵，植株菌丝率提高到60%以上。接种灰霉菌2 d后，2种植株无极显著差异，直至第5天时，叶片与茎褐色化显著，而且植株叶片几乎完全褐色化。表明真菌侵染小立碗藓的防卫反应主要发生在早期。

A：灰霉菌侵染小立碗鲜形态观察， Bar =1 mm；B：野生型与突变型侵入菌丝率的比较。

Figure 4 Infected behavior ofon

3 讨论与结论

小立碗藓全基因组测序已经完成，具有较高的同源重组效率，其原生质体再生能力强，有利于进行基因重组实验[22]。本次研究采取的是20% PEG 6000作为诱导剂进行转化实验；而且PTN182质粒含有Ⅱ基因在小立碗藓中表现为G418抗性，因此可用不同浓度的G418筛选突变株[23]。此外，用于小立碗藓基因转化的方式主要有两种：PEG介导的遗传转化和农杆菌介导的遗传转化。PEG是一种化学诱导剂，在高pH和钙离子的环境下加入一定浓度的PEG有利于外源DNA分子摄入原生质体[22, 24]。而利用农杆菌介导的原生质体遗传转化其转基因植株的获得周期较长；出现假阳性的频率比较高[25]。因此采用PEG介导小立碗藓原生质体转化进行实验。

本研究中的引物Q3没有扩增得到上游臂外围到下游臂外围基因的片段，其原因可能是下游臂是以某种方式插入到基因上而非进行了同源重组替换。但是下游臂以插入的方式替换掉了的部分基因同样是可以破坏掉基因，致使基因不能够正常转录，从而影响其蛋白质的表达[26]。因此，该突变植株同样可以用于后续功能研究。

小立碗藓敲除载体构建并成功转入小立碗藓中获得突变植株为探索在小立碗藓的生长发育及是否参与生物胁迫等研究建立基础。通过观察，突变株配子体的叶片数量相比于野生型更多，排列更为紧凑。其配子体的表型与野生型配子体有着较大的差异，推测破坏基因的表达可能会导致小立碗藓叶片增加。前期研究表明，敲除基因后突变植株没有变化，而基因独特的进化关系可能与小立碗藓的形态建成有关。

敲除基因后小立碗鲜对灰霉菌的敏感性增加，表现为更易感病。在灰霉菌感染前期，菌丝入侵细胞行为并不明显，可能是这个时期的灰霉菌孢子还未萌发。研究表明，灰霉菌孢子需要经过4 h的预萌发阶段[27]。在灰霉菌侵染小立碗鲜12 h后，突变株侵入菌丝显著增加，推测基因调控植物细胞壁物质发生变化，在防卫反应的早期增强植物抗病。因此，通过构建敲除载体并成功获得的突变植株为研究基因功能以及早期陆生植物的生长发育奠定了一定基础。

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Construction ofgene knockout vector and function study ofin

TIAN Xu, YAN Huiqing, LIU Lu, XIE Li, CHENG Liang, JIANG Shan

(School of Life Science, Guizhou Normal University, Guiyang 550025)

Lignin is an important component of plants against the external environment. Cinnamyl-alcohol dehydrogenase (CAD) is one of the key enzymes and rate-limiting enzymes in the pathway of lignin synthesis. The previous data showed that the expression ofinwas upregulated afterassault, however, the function ofremained obscure in. In this study, knockoutvector was constructed in terms of homologous recombination, which could disrupt the alcohol dehydrogenase GroES-like (ADH_N) and zinc-binding dehydrogenase (ADH_zinc_N) domains encoded by PpCAD4. Subsequently, themutant plant was obtained by protoplast transformation mediated by PGE 6000 and identified by PCR. Compared with wild-type (WT), qRT-PCR analysis indicated that the expression ofinmutant plant was reduced by 84%. Interestingly, the number of phyllids and plant biom ass inmutant plant were increased, suggesting thatplays an important role in the growth and development in the early terrestrial plants. The rate of infected hyphae was 15% in WT, whereas the rate was 40% in theplant at 0.5 dpi (days post inoculated). The rate of infected hyphae ofwas 2 times of WT at 1 dpi. The result indicated thatcan increase the resistance ofagainst.

lignin; cinnamyl-alcohol dehydrogenase;;; gene knockout;

10.13610/j.cnki.1672-352x.20230625.024

2023-06-26 16:10:35

Q782

A

1672-352X (2023)03-0423-06

2022-04-27

国家自然科学基金(32060587, 32060611)和贵州省自然科学基金重点项目(ZK[2023]ZD026)共同资助。

田 旭，硕士研究生。E-mail：tianxu0825@126.com

通信作者:姜 山，教授。E-mail：kyosan200312@hotmail.com

[URL] https://kns.cnki.net/kcms2/detail/34.1162.S.20230625.1534.048.html