艳山姜挥发油对四氧嘧啶诱导的胰岛细胞损伤保护作用及机制*

文波, 罗芳, 付凌云, 徐旖旎, 陶玲, 张甜, 林浩恒, 沈祥春**

(1.贵州医科大学 药学院 天然药物资源优效利用重点实验室 &贵州省高等学校天然药理与成药性评价重点实验室, 贵州 贵阳 550025; 2.贵州医科大学附属医院 神经内科, 贵州 贵阳 550001)

糖尿病(diabetic mellitus, DM)是一种在全球范围内广泛流行的体内胰岛素的相对或绝对分泌不足引起的糖、脂及蛋白质代谢紊乱,伴有多种并发症且尚无法根治的内分泌疾病[1-4],其中2型糖尿病占DM总发病率的90%[5]。DM的病理生理机制主要包括胰岛细胞受损和胰岛素抵抗两个方面。NIT-1细胞是胰岛细胞的一种,通过分泌胰岛素调节机体血糖,在DM的形成中发挥关键性作用。胰岛功能受损是2型糖尿病的主要特征之一[6],四氧嘧啶通过产生超氧自由基选择性地破坏NIT-1细胞,使其数目减少、功能受损,从而胰岛素分泌减少,进一步导致DM的产生。因此,抑制胰岛细胞数量减少和恢复胰岛正常功能对治疗DM及减少并发症的发生有着重要作用。艳山姜源于姜科植物艳山姜Alpiniazerumbet(Pers.)Burtt.et Smith的干燥成熟果实,主要含有挥发油类、黄酮类和二萜类等成分[7-8]。本实验室以往研究证实,艳山姜挥发油(essential oil from fructusalpiniaezerumbet, EOFAZ)具有广泛的抗高血压、抗动脉粥样硬化、抗炎镇痛、抗氧化、抗高尿酸等心血管药理活性[9-14]。本研究在前期研究的基础上,结合DM发生过程中关键细胞的病变特征,探讨EOFAZ对四氧嘧啶诱导NIT-1胰岛细胞凋亡的保护作用及可能的机制,以期为贵州民族药艳山姜的进一步开发应用提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1细胞株 大鼠胰岛细胞(NIT-1)株购自于美国American Type Culture Collection公司。

1.1.2药物 利用水蒸气蒸馏法提取EOFAZ后,精密称取30 μL(约29 mg),加二甲基亚砜2.9 mL溶解,配制成10 g/L的母液,0.22 μm微孔滤膜除菌,放置4 ℃备用。实验时用无血清培养基稀释成不同浓度给药。

1.1.3主要试剂 MTT(美国Sigma),四氧嘧啶(美国Aldrich),丙二醛(malondialdehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-PX)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase dehydrogenase, LDH)以及胰岛素检测试剂盒(南京建成),RPMI-1640培养基、胰蛋白酶以及RIPA裂解液(美国Gibco),B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)、Bcl-2关联X蛋白(BCL2-associated X, Bax)以及半胱氨酸-天冬氨酸特异性蛋白酶9(cysteinyl aspartate specific proteinase, Caspase-9)抗体(美国Cell signaling Technology),羊抗鼠、羊抗兔IgG抗体(美国Santa Cruz),Z-VAD-FMK抑制剂(上海碧云天),ECL发光液(美国Thermo scientific)。

1.1.4主要仪器 SW-CJ2FD双人单面净化工作台(浙江孚夏),BXM-30R立式压力蒸汽灭菌器(上海博讯),170-3930垂直电泳系统、CFX凝胶成像系统(美国Bio-Rad),ELX800酶联免疫检测仪(美国伯腾),5424R低温冷冻离心机(德国eppendorf),CKX53倒置相差显微镜(日本Olympus),700-SERIES超低温冰箱(美国Thermo scientific),MCO-18AC CO2细胞培养箱(苏州净化),IMS-50制冰机(常熟市雪科电器),Milli-Q型纯水机(武汉天恒)。

1.2 研究方法

1.2.1NIT-1细胞培养 液氮中取出NIT-1细胞立即放入37 ℃水浴中以迅速解冻。随后接种于培养瓶中,加入含10% 胎牛血清的RPMI-1640培养基,于37 ℃,5% CO2饱和湿度条件的培养箱中培养,隔夜换液。待其生长约80%,用0.25%的胰酶消化,培养基中和后离心弃上清,计数后加新鲜培养基完成传代。取对数生长期细胞用于后续实验。

1.2.2四氧嘧啶诱导NIT-1细胞损伤浓度的筛选 将处于对数生长期的NIT-1细胞以1×105个/mL密度接种到96孔板中,每孔100 μL。培养后24 h换液,待其长满后,加入浓度分别为0、1、4、10、20、40、60、80、100 mmol/L的四氧嘧啶,每种浓度设6个复孔,培养24 h后进行MTT检测。各孔加入5 g/L MTT 20 μL,继续孵育4 h,弃上清,每孔加 DMSO溶液150 μL,于低速摇床上震荡10 min,使蓝色结晶完全溶解。在酶标仪490 nm波长处测定各孔OD值,根据每孔OD值计算各组细胞存活率,确定造模浓度。实验重复3次。计算公式如下:细胞存活率=(给药组OD值-空白调零组OD值)/(对照组OD值-空白调零组OD值)×100%。

1.2.3分组与给药 根据实验室前期研究结果确定EOFAZ的给药剂量[9,15]。实验分为5组:对照组(无血清培养基)、模型组(40 mmol/L四氧嘧啶)、EOFAZ低剂量组(50 μg/L EOFAZ+40 mmol/L四氧嘧啶)、EOFAZ中剂量组(100 μg/L EOFAZ+40 mmol/L四氧嘧啶)以及EOFAZ高剂量组(200 μg/L EOFAZ+40 mmol/L四氧嘧啶)。机制研究分为5组:对照组(无血清培养基)、模型组(40 mmol/L四氧嘧啶)、EOFAZ组(200 μg/L EOFAZ+40 mmol/L四氧嘧啶)、Z-VAD-FMK组(10 μmol/L Z-VAD-FMK+40 mmol/L四氧嘧啶)、EOFAZ+Z-VAD-FMK组(200 μg/L EOFAZ+10 μmol/L Z-VAD-FMK+40 mmol/L四氧嘧啶)。按照对应分组给药,进行后续指标检测。

1.2.4MTT法检测细胞存活率 将细胞接种于96孔板中,待生长密度约80%时,按照方法“1.2.3”项处理,每组6个复孔;随后按“1.2.2”项下MTT检测步骤测定细胞存活率。

1.2.5生化法检测MDA、SOD和GSH-PX的含量 将细胞接种于96孔板中,按照方法“1.2.3.”项处理。收集细胞上清液后,根据试剂盒说明书检测细胞上清液中MDA、SOD、GSH-Px的含量。

1.2.6ELISA法检测LDH和胰岛素分泌量 将细胞接种于96孔板中,按照方法“1.2.3”项处理。收集细胞上清液后,根据试剂盒说明书检测细胞上清液中LDH的外漏量和胰岛素的分泌量。

1.2.7Western Blot检测分析Bcl-2、Bax以及Caspase-9蛋白的表达 将细胞接种于6孔板中,按照“1.2.3”项处理后,PBS润洗3次弃去孔内液体,加入细胞裂解液与PMSF蛋白抑制剂裂解细胞,离心后收集上清,BCA法定量,变性分装后采用SDS-PAGE法进行电泳。充分分离蛋白转移至PVDF膜,BSA封闭1.5 h,加入稀释比为1∶1 000的Bax、Bcl-2、Caspase-9、β-actin抗体冰箱孵育过夜。次日回收一抗,清洗后加稀释比为1∶10 000的二抗室温孵育2 h,回收二抗,洗涤3次,ECL显影,采用凝胶成像系统进行成像和数据分析。以β-actin作为内参进行归一化处理,计算蛋白的表达量。实验重复3次。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 NIT-1细胞损伤模型

采用浓度为1、4、10、20、40、60、80、100 mmol/L的四氧嘧啶分别作用于NIT-1细胞后,细胞存活率呈浓度依耐性降低。与0 mmol/L的四氧嘧啶组细胞比较比较,从4 mmol/L四氧嘧啶浓度从4 mmol/L开始,之后各浓度组细胞存活率下降,差异有统计学意义(P<0.05)。本实验选择40 mmol/L(存活率为70.7%)为诱导细胞最佳损伤浓度。见表1。

表1 不同浓度四氧嘧啶对NIT-1细胞存活率的影响

2.2 EOFAZ对NIT-1细胞存活率的影响

与对照组比较,模型组NIT-1细胞存活率降低,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,EOFAZ各剂量组NIT-1细胞存活率升高,差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

注：(1)与对照组比较,P<0.05;(2)与模型组比较,P<0.05。

2.3 EOFAZ对NIT-1细胞MDA、SOD、GSH-PX和LDH水平的影响

与对照组比较,模型组NIT-1细胞中MDA和LDH含量增加,SOD和GSH-PX含量降低,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,除EOFAZ低剂量组MDA和SOD比较差异无统计学意义外(P>0.05),其余剂量组MDA和LDH含量降低(P<0.05),SOD和GSH-PX含量升高(P<0.05)。见图2。

注：(1)与对照组比较,P<0.05;(2)与模型组比较,P<0.05。

2.4 EOFAZ对NIT-1细胞胰岛素分泌的影响

与对照组比较,模型组胰岛素分泌减少(P<0.05);与模型组比较,EOFAZ各剂量组胰岛素分泌增多(P<0.05)。见图3。

注：(1)与对照组比较,P<0.05;(2)与模型组比较,P<0.05。

2.5 EOFAZ对NIT-1细胞中Bax、Bcl-2和Caspase 9蛋白表达的影响

与对照组比较,模型组 Bax和Caspase 9蛋白表达上调(P<0.05),Bcl-2蛋白表达下调(P<0.05),Bax/Bcl-2升高(P<0.05);与模型组比较,除EOFAZ低剂量组Bcl-2蛋白表达比较差异无统计学意义外(P>0.05),其余剂量组Bax和Caspase 9蛋白表达下调(P<0.05),Bcl-2蛋白表达上调(P<0.05),Bax/Bcl-2降低(P<0.05)。见图4。

注：A为蛋白条带图,B-E分别为Bax、Bcl-2、Bax/Bcl-2及Caspase-9蛋白的定量表达; (1)与对照组比较,P<0.05;(2)与模型组比较,P<0.05。

2.6 Caspase抑制剂作用下EOFAZ对四氧嘧啶诱导NIT-1细胞Caspase-9蛋白表达的影响

与对照组比较,模型组Caspase 9蛋白表达上调(P<0.05);与模型组比较,EOFAZ组Caspase 9蛋白表达下调(P<0.05);与EOFAZ组、Z-VAD-FMK组分别比较,EOFAZ+Z-VAD-FMK组Caspase 9蛋白表达均下调(P<0.05)。见图5。

注：A为蛋白条带图,B为Caspase-9蛋白的定量表达;(1)与对照组比较,P<0.05;(2)与模型组比较,P<0.05;(3)与EOFAZ组比较,P<0.05;(4)与Z-VAD-FMK比较,P<0.05。

3 讨论

胰岛细胞损伤、胰岛素分泌不足是导致DM的关键病理过程。各种因素如外界刺激(如高糖高脂)、炎症、氧化应激等均可引起胰岛细胞损伤,导致细胞膜通透性改变、细胞凋亡相关通路被激活,主要表现为细胞收缩、体积变小、胞质密集、细胞器和染色质联系更为紧密、胞核碎裂以及凋亡小体形成[16]。四氧嘧啶是自由基活性剂,主要通过产生超氧自由基破坏胰岛β细胞导致胰岛素合成减少,从而使机体血糖升高。腹腔给予四氧嘧啶构建糖尿病动物模型的成功率在90%以上,因此可用于复制2型糖尿病模型[17-19]。机体通过维持氧化系统和抗氧化系统的平衡保证正常功能。LDH可反应细胞损伤程度,当细胞损伤时,细胞内过氧化物质如ROS、MDA、CAT增多,而抗氧化物质如SOD、GSH-PX等减少。本研究发现,EOFAZ干预后,MDA含量和LDH外漏量具有不同程度减少,而SOD和GSH-PX增多,提示EOFAZ可通过加强细胞清除自由基的能力,减少细胞氧化应激损伤,从而发挥保护作用。此外,胰岛素检测结果表明,EOFAZ作用后,胰岛素分泌增多,提示其可通过减少损伤恢复胰岛细胞功能促进胰岛素的释放。

在细胞凋亡过程中,凋亡蛋白分子发挥调控作用,Caspase蛋白的活化是导致细胞凋亡的中心环节。Caspase-9是内源性或线粒体凋亡途径的凋亡起始蛋白酶,也是Caspase家族的重要代表,可启动和触发内在细胞凋亡信号然后传递到下游,诱导细胞级联损伤,引起细胞死亡[20-21]。Bax与Bcl-2属于同一家族,两者之间的比例关系是决定对细胞凋亡抑制作用强弱的关键因素[22],当细胞损伤或凋亡时,Bax表达异常增多,Bcl-2表达异常减少,从而导致Bax与Bcl-2的比值(Bax/Bcl-2)异常降低。本研究发现,经过EOFAZ预处理后能明显增加细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平,减少Bax和Caspase-9凋亡蛋白的表达水平,且Bax与Bcl-2的比值统计结果也证实了EOFAZ能改善两者之间的异常表达状态。为进一步明确其作用与抑制凋亡是否相关,本实验继续采用了凋亡蛋白有效抑制剂Z-VAD-FMK进行验证。结果显示,当采用EOFAZ联用凋亡蛋白抑制剂后,Caspase-9表达进一步降低。提示EOFAZ可协同Z-VAD-FMK抑制Caspase-9蛋白表达,证实EOFAZ抑制四氧嘧啶诱导NIT-1的损伤与抑制细胞凋亡密切相关。尽管当前研究对于EOFAZ保护NIT-1细胞损伤的作用和机制有了一定的认识,但仍不深入,是否通过其他信号通路发挥作用有待进一步研究,有望有更多发现其可能具备潜在的降血糖的功能。

综上所述,EOFAZ对四氧嘧啶诱导的NIT-1细胞损伤具有保护作用,其机制与提高胰岛细清除自由基的能力和抑制细胞凋亡作用有关。