8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶在顺铂诱导的急性肾损伤中的作用和机制

张明娇 朱杰夫 吴雄飞

顺铂是目前肿瘤治疗的重要药物之一[1],肾毒性是其主要毒副作用[2],接受顺铂治疗的肿瘤住院患者中,急性肾损伤(AKI)发生率可达20%[3]。研究发现,顺铂诱导的AKI与细胞对顺铂的摄取和排泄、细胞凋亡、血管损伤、氧化和内质网应激以及炎症有关[4]。其中炎症反应是顺铂诱导的AKI的关键机制之一,但其潜在具体机制尚未完全清楚。

8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶(OGG1)是双链DNA中切除8-氧代鸟嘌呤(8-oxoG)并启动碱基切除修复的主要DNA糖基化酶。Th5487作为一种有效的OGG1选择性活性位点抑制剂,可防止OGG1与其DNA底物结合[5],降低OGG1在DNA损伤区域中的募集,暴露于氧化应激的细胞中的DNA双链断裂减少,并且能够诱导基因组8-oxoG的积累[6]。Th5487在顺铂诱导的AKI中的作用及机制鲜有报道,本研究使用Th5487探究OGG1是否能通过环鸟苷酸-腺苷酸合成酶-干扰素基因刺激因子(cGAS-STING)信号调节顺铂引起的炎症反应,减轻肾脏损伤。

材料和方法

实验材料

实验细胞系 小鼠肾近端小管上皮细胞系(BUMPT细胞)最初取自Wilfred Lieberthal博士(波士顿大学医学院),受赠于中南大学湘雅医学院。细胞采用含10% FBS、1%青链霉素的高葡萄糖DMEM培养基,在37 ℃、5% CO2和95%空气中培育。

实验动物 选取SPF级雄性C57BL/6小鼠48只,8～10周龄,体重22～25 g。小鼠购自武汉大学口腔医院(实验动物合格证号:SYXK(鄂)2019-0079)。本实验经武汉大学人民医院动物护理和使用委员会批准[批准文号WDRM动(福)第202110707号]。

药品与试剂 Th5487(细胞5 μmol/L[7],动物30 mg/kg,Med Chem Express,HY-125276)、顺铂(细胞20 μmol/L,动物20 mg/kg)、胎牛血清(中国四季青公司),高糖培养基(Hyclone公司)。细胞计数(CCK-8)试剂盒、线粒体膜电位检测(JC-1)试剂盒(C2006)、活性氧(ROS)检测试剂盒(S0033S)、CuZn/Mn-SOD活性检测试剂盒(WST-8法)(S0103)均购自中国碧云天生物,8-oxoG ELISA试剂盒(江莱生物,JL45397),TRIzol试剂、转录试剂盒、SYBR Green混合物购自中国翌圣生物。OGG1抗体(Novus Biologicals,NB100-106)、cGAS抗体(Abcam,ab252416)、STING抗体(Immunoway,YT5488)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)抗体(Immunoway,YT4689)、GAPDH抗体(Proteintech,60004-1-IG),MPO抗体(Abcam,ab208670)。

仪器与设备 液氮研磨仪(德国Retsch),正置显微镜(奥林巴斯BX53),多功能成像酶标仪(PerkinElmer),荧光定量PCR仪(Bio-Rad CFX Connect),化学发光凝胶成像系统(Bio-Rad)。

实验方法

细胞模型 检测0～80 μmol/L不同顺铂浓度干预时的细胞活力,确定顺铂干预剂量为20 μmol/L。细胞分为4组:溶剂对照组、Th5487组、顺铂组和顺铂+Th5487组分别更换含溶剂、Th5487、顺铂、顺铂+Th5487的培养基培养6 h。

动物模型 24只小鼠随机分为4组(n=6):顺铂处理0 h组、24 h组、48 h组和72 h组。分别在处死小鼠前72 h、48 h、24 h和0 h腹腔注射顺铂溶液。另取24只小鼠随机分为4组(n=6),分别为生理盐水对照组、Th5487组、顺铂组、顺铂+Th5487组,处死小鼠72 h前经腹腔给予含不同试剂的溶液(生理盐水20 mg/kg)。

标本采集 戊巴比妥钠60 mg/kg腹腔注射麻醉后,迅速从脊柱两侧打开,观察肾脏情况并分离,切取部分肾组织置于10%多聚甲醛固定,其余组织放入-80 ℃备用。

线粒体膜电位(MMP)测量 按照说明制备JC-1染色工作液。染料与细胞在37 ℃,5% CO2环境中孵育30 min,洗涤后加入培养基,荧光显微镜下观察。当MMP高时,形成JC-1聚集体,产生红色荧光。当MMP低时,JC-1为单体,产生绿色荧光[8]。JC-1聚集体和JC-1单体的平均荧光强度分别量化,数据报告为单体/聚集体的平均荧光强度。

ROS检测 根据试剂盒说明书稀释DCFH-DA到10 μmol/L,将稀释后的DCFH-DA加入细胞培养板,37 ℃孵育20 min,洗涤后用酶标仪检测荧光。

超氧化物歧化酶(SOD)活性检测 取适量组织样品进行研磨,4 ℃离心,取上清作为待测样品。根据说明配制WST-8/酶工作液和反应启动工作液。在96孔板中依次加入待测样品、SOD检测缓冲液、WST-8/酶工作液,最后加入反应启动工作液,混匀。37 ℃孵育30 min。根据450 nm处吸光度计算SOD活力。

8-oxoG含量检测 按照ELISA试剂盒说明书处理肾脏,配制标准品,在96孔板加入样品,37 ℃孵育2 h,弃去液体,甩干。加入检测溶液A工作液,37 ℃孵育1 h,浸泡洗涤。加检测溶液B工作液,37 ℃孵育1 h,洗涤。加入底物,37 ℃避光显色25 min,终止反应,在450 nm波长处测量吸光度值,计算8-oxoG含量。

肾脏病理损伤评估 将肾组织固定在4%多聚甲醛溶液中24 h,清洗后在梯度乙醇中脱水,石蜡包埋并切成4 μm的切片。苏木精-伊红染料染色后在显微镜下观察并拍摄。各组小鼠肾脏损伤情况评分:肾小管无损伤(0分);轻度0%～25%(1分);中度25%～50%(2分);重度50%～75%(3分);极重75%～100%(4分)[9]。

髓过氧化物酶(MPO)免疫组化染色 将石蜡切片在65℃脱蜡,100℃的柠檬酸盐缓冲溶液(pH 6.0)中抗原修复30 min。室温下5% BSA封闭1 h后,切片与OGG1抗体(1∶100)和MPO抗体(1∶100)4 ℃孵育过夜。与二抗室温孵育1 h,加入DAB染色剂,苏木精复染。封片后显微镜下观察,使用《ImageJ》软件量化阳性染色区域的平均吸光度。

实时定量PCR(RT-qPCR)检测mRNA表达 提取肾皮质中总RNA,逆转录成cDNA。RT-qPCR程序设定为95 ℃预变性2 min,95 ℃变性20 s,60 ℃延伸30 s,共40个循环。用2-ΔΔCt法计算出目的基因的相对表达量。实验独立重复3次。引物序列如下:

OGG1 F:5′-AAACTTTTTCCGGAATCTGTGG-3′

R:5′-CTTAGATCCCTTTTTGCGCTTT-3′

cGAS F:5′-CAGGAAGGAACCGGACAAGCTAAAG-3′

R:5′-CCGACTCCCGTTTCTGCATTCTG-3′

STING F:5′-CCGAAGACTGTACATCCTCTTT-3′

R:5′-AGCATATCTCGGAATCGAATGT-3′

TNF-α F:5′-ATGTCTCAGCCTCTTCTCATTC-3′

R:5′-GCTTGTCACTCGAATTTTGAGA-3′

mtDNA F:5′-TTTTATCTGCATCTGAGTTTAATCCTGT-3′

R:5′-CCACTTCATCTTACCATTTATTATCGC-3′

结论:总而言之,对肠造口患者而言,其可能一生都无法像健康人一样进行排便,因此,掌握造口自我护理技能对改善生活状况、提高生活质量具有极为重要的意义。但由于造口护理具有繁琐性与专业性,护理人员应主动对患者进行指导,帮助其尽快熟悉造口护理。与此同时,医院应主动组织护理人员进行培养,提高其专业技能与知识素养,从而使得其在工作中能游刃有余地对患者进行系统而规范的指导。除此之外,护理人员还应主动为患者介绍相关社会支持机构,便于他们及时有效地获取帮助,从而不断提高肠造口患者的整体生活质量。

GAPDH F:5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′

R:5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′

Western Blot法检测蛋白 提取总蛋白,测定蛋白浓度。用SDS-PAGE分离蛋白,5%脱脂奶粉封闭。封闭后分别与OGG1抗体(1∶1 000)、cGAS抗体(1∶1 000)、STING抗体(1∶1 000)、TNF-α抗体(1∶1 000)、GAPDH抗体(1∶20 000)孵育,4 ℃过夜。室温下与二抗溶液孵育1 h,清洗后显影。使用ImageJ软件对显影的条带进行灰度分析,并进行半定量。

统计学方法使用《GraphPad 8.0》软件进行统计分析,数据以均数±标准差表示,方差齐时采用带/不带重复测量的单因素方差分析与Tukey检验,不满足方差齐性时采用Friedman检验/Kruskal-Wallis检验与Dunnett-t检验来推断多组间差异并进行两两比较。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

Th5487可减轻顺铂引起的肾脏损伤随顺铂处理时间延长,小鼠血清肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)水平逐渐升高(P<0.05)(图1A)。随着处理时间延长,光镜下肾组织逐渐出现小管细胞脱落,管腔蛋白渗出,管型形成,肾小管扩张,小管细胞坏死,肾脏损伤不断加重(P<0.05)(图1B)。顺铂干预使小鼠肾脏中OGG1的mRNA水平和蛋白表达增加(P<0.05)(图1C)。免疫组化结果也提示OGG1在顺铂干预后表达增加且在肾小球和肾小管上皮中都有分布(P<0.05)(图1D)。Western Blot结果显示顺铂增加了肾组织cGAS、STING及TNF-α蛋白表达(P<0.05)(图1E)。RT-qPCR检测各组小鼠肾皮质中基因表达,与对照组相比,cGAS、STING和TNF-α的mRNA水平在顺铂处理后有不同程度升高(P<0.05),而mtDNA的完整度变化不显著(P>0.05)(图1F)。

图1 各组小鼠肾功能、HE染色、免疫组化和OGG1及炎症因子表达

Th5487可抑制顺铂诱导的cGAS-STING信号轴单纯Th5487与对照组SCr、BUN水平无明显差别,与顺铂组相比,Th5487组抑制OGG1后小鼠SCr、BUN水平显著下降(P<0.05)(图2A)。光镜下可加入Th5487后肾脏损伤有所减轻,小鼠肾脏损伤评分较顺铂组降低(P<0.05)(图2B)。MPO免疫组化结果显示,与对照组相比,顺铂组肾组织炎性浸润明显增加,Th5487减轻了炎细胞浸润程度(图2C)。BUMPT细胞和小鼠肾脏的Western Blot结果都显示,单纯Th5487对cGAS、STING、TNF-α的水平无影响(P>0.05)。与顺铂组比较,加入Th5487后cGAS、STING、TNF-α蛋白的表达受到抑制(P<0.05)(图2D、E)。提示Th5487降低了BUMPT细胞和小鼠肾脏中炎症调节因子的表达。

图2 Th5487对顺铂介导的小鼠肾功能、炎细胞浸润及小鼠和细胞中炎症相关蛋白的影响

Th5487对顺铂诱导的线粒体功能和组织损伤的影响使用JC-1试剂盒检测细胞MMP变化,顺铂干预后细胞内呈现出明显绿色荧光(P<0.05),与顺铂组相比,加入Th5487使BUMPT细胞中红光增强,绿光减弱,线粒体膜电位下降明显缓解(P<0.05)(图3A),表明顺铂使BUMPT细胞MMP发生去极化,而Th5487能减轻BUMPT细胞内MMP的去极化水平。顺铂处理后BUMPT细胞中ROS生成也显著增加(P<0.05),Th5487抑制了顺铂诱导的细胞内ROS水平上升(P<0.05)(图3B)。利用CuZn/Mn-SOD活性检测试剂盒检测肾组织匀浆中SOD活力,与对照组相比,顺铂组SOD活力明显受抑制,加入Th5487后,SOD抑制程度减轻(P<0.05)(图3C)。ELISA结果显示,与对照组相比,顺铂组的8-oxoG含量更高,加入Th5487后,8-oxoG明显减少(P<0.05)(图3D)。

图3 Th5487对顺铂介导的小鼠肾近曲小管细胞中MMP、ROS和肾组织中SOD及8-oxoG的影响

讨 论

有研究表明,cGAS-STING信号在顺铂处理的小鼠肾脏中激活,STING敲除或抑制剂能改善顺铂诱导的肾损伤和促炎因子的产生[17-18]。cGAS-STING信号通过增强核苷酸切除修复途径[19]和细胞中的线粒体DNA(mtDNA)释放[20]诱导。逃离应激线粒体的mtDNA通过激活cGAS-STING途径引起炎症[21]。既往研究表明,OGG1小分子抑制剂SU0268诱导mtDNA-cGAS-STING-IFN-β轴,从而减少细菌负荷并阻止疾病进展[22]。在有皮肤表现的系统性红斑狼疮(SLE)患者中,OGG1-/-的SLE小鼠模型表现出cGAS依赖的IFN-β表达[23]。在本实验中,顺铂诱导AKI小鼠肾组织中cGAS-STING信号通路激活,最终损伤小鼠肾脏结构与功能。Th5487的使用减少了小鼠肾脏肾小管上皮细胞中cGAS、STING、TNF-α蛋白表达,抑制了cGAS-STING信号诱导的炎症反应。

线粒体功能障碍和细胞内ROS积累诱导的氧化应激是顺铂诱导的AKI的标志,不受控制的线粒体损伤和ROS积累将激活随后的细胞炎症和细胞死亡。本研究发现,在顺铂处理后BUMPT细胞MMP去极化,ROS积累增加。Th5487使MMP去极化减弱,ROS积累减少。进一步检测发现,Th5487能减轻顺铂引起的肾组织匀浆中SOD活力下降,缓解顺铂诱导的组织氧化损伤。Th5487还能降低组织8-oxoG含量。研究提示,OGG1可能通过促进cGAS-STING信号加重顺铂诱导的AKI中的炎症反应,但其具体机制仍需要进一步探索。

目前,顺铂肾毒性的缓解或预防可通过短时间、低容量补液、补充镁或甘露醇诱导强制利尿来实现[24]。然而,现有的治疗常伴随患者的过度利尿和随后的脱水,迫切需要安全有效的靶点预防顺铂肾毒性。OGG1调节cGAS-STING信号影响顺铂诱导的AKI中的炎症反应,这为肿瘤病人使用铂类化合物治疗时减少肾毒性带来了另一种可能。