烟田小地老虎高致病力球孢白僵菌的筛选

程凯凯，孙卉镁，曹 付，雷 晓，徐传涛，刘 苏，李茂业*

（1.安徽农业大学植物保护学院，植物病虫害生物学与绿色防控安徽普通高校重点实验室，合肥 230036；2.四川省烟草公司泸州市公司，四川 泸州 646600）

烟草是我国重要的经济作物，在烟草种植过程中，常会受到土栖害虫的为害[1]。小地老虎（Agrotis ipsilon）是为害烟草最为严重的土栖害虫之一，其幼虫常将烟苗咬断，造成缺苗断垅[2-3]。化学防治是控制小地老虎为害的主要方法[4-5]。但化学杀虫剂的高频率使用，不但污染烟田环境，降低烟叶品质，而且会诱导小地老虎产生抗药性[6]。因此，亟需寻找针对小地老虎的新型绿色防控措施。

昆虫病原真菌是一类能够通过体壁侵染昆虫并导致昆虫死亡的真菌，在烟田害虫的综合防治中具有成本低、无环境污染以及害虫不产生抗性等优点[7-9]。球孢白僵菌（Beauveriabassiana）是应用最为广泛的昆虫病原真菌之一，该菌对黄地老虎和蛴螬等多种土栖害虫具有良好的防治效果[10-13]。但截至目前，有关小地老虎高毒力球孢白僵菌的报道仍然较少，限制了球孢白僵菌在小地老虎防治中的应用。为获得对小地老虎具有高致病力的球孢白僵菌菌株，本论文研究了9 株球孢白僵菌的生物学特性及对小地老虎幼虫的致病力，以期为小地老虎的生物防治提供前期基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株、虫源和试剂

菌株：9 株球孢白僵菌均为本实验室保存，菌株寄主及采集地信息见表1。

表1 供试球孢白僵菌菌株信息Table 1 Information of the tested Beauveria bassiana strains

虫源：小地老虎于2021 年采集自四川省泸州市叙永县烟田，在本实验室饲养多代。小地老虎幼虫饲喂小白菜，待其化蛹后，将蛹单头放置于玻璃指形管中，羽化的成虫饲喂10%（V/V）蜂蜜水。饲养条件为温度（25±1）℃、相对湿度（RH）（75±5）%、光周期16 h/d。

试剂：SDAY 培养基（葡萄糖40 g、酵母浸出粉10 g、蛋白胨10 g、琼脂粉20 g、蒸馏水1000 mL，高温高压灭菌）；吐温-80（化学纯，购自国药集团化学试剂有限公司）。

1.2 菌株生物学性状观测

将冰箱中保存的菌株取出，用接种针挑取少量孢子接种到SDAY 培养基上，在（25±1）℃、（90±5）%RH、全黑暗条件下培养15 d。用灭菌的打孔器（孔径6 mm）在菌落边缘打取1 个菌碟，接种于新的SDAY 培养平板中央，倒置于（25±1）℃、RH（90±5）%、全黑暗条件下培养。接种后第12 天用十字交叉法测量菌落直径。随后用孔径6 mm 的打孔器在菌落边缘处打取菌碟4 个（十字交叉线的纵横方向各2 个），置于灭菌的玻璃试管中，加入10 mL 0.05%（V/V）吐温-80 水溶液，涡旋振荡10 min，用擦镜纸滤去菌丝，获得孢子悬浮液。取10 μL 孢子悬浮液滴至血球计数板上，统计孢子数量，计算产孢量。将孢子悬浮液稀释至1×106孢子/mL，吸取15 μL 滴在预先涂有一薄层SDAY 固体培养基的载玻片上，置于（25±1）℃、（90±5）% RH、全黑暗条件下培养18 h 后在光学显微镜下观察5 个不同视野，统计萌发的孢子数量（芽管长度超过孢子直径的1/2 视为萌发），计算孢子萌发率。以上试验均设5 次生物学重复。

1.3 高致病力菌株筛选

将供试菌株接种于 SDAY 培养平板，在（25±1）℃、（90±5）% RH、全黑暗条件下培养15 d。将菌丝和孢子刮下，置于0.05%（V/V）吐温-80水溶液中，涡旋振荡10 min，用擦镜纸滤去菌丝，得到孢子悬浮液，并将其浓度稀释为2×107孢子/mL。采用浸渍法[14]测定各菌株对小地老虎2 龄幼虫的致病力：将试虫浸入各菌株孢子悬浮液2 s 后取出，用滤纸吸去试虫体表多余液体，移入培养皿中（每皿1 头试虫），放入（25±1）℃、（75±5）% RH、光周期16 h/d 人工气候箱中，逐日记录死亡虫数，连续记录8 d，计算致死中时间（median lethal time，LT50）。每处理设3 次生物学重复，每重复30 头试虫，以0.05%（V/V）吐温-80 水溶液处理为对照。

1.4 Bb324 菌株致死中浓度测定

将致病力最高的Bb324 菌株配制为2×104、2×105、2×106、2×107和2×108孢子/mL 共5 个浓度的孢子悬浮液，采用浸渍法（同1.3 节），测定其侵染小地老虎2 龄幼虫造成的死亡率，计算致死中浓度（median lethal concentration，LC50）。每处理设3次生物学重复，每重复30 头试虫，对照组为0.05%（V/V）吐温-80 水溶液。

1.5 Bb324 侵染过程与试虫症状观察

将Bb324 菌株配制为2×108孢子/mL的悬浮液，用浸渍法（同1.3 节）侵染小地老虎2 龄幼虫，用体视镜每日观测试虫症状。

1.6 数据统计

使用WPS Office 2019 版软件计算孢子萌发率和试虫校正死亡率；使用DPS v9.05 软件拟合回归方程并计算LT50和LC50；采用Duncan 氏新复极差法分析不同处理组间的差异显著性。计算公式为：

2 结 果

2.1 菌株形态和培养性状

9 株供试球孢白僵菌的菌落和孢子粉均为白色或乳白色，在SDAY 培养基上的菌落形态主要有2种类型：粉状菌落和疏松状菌落（图1）。粉状菌落（如Bbz2 和Bb324）特点为菌丝较少、产孢早且产孢量大；而疏松状菌落（如Bb03 和Bb12）特点为菌丝较多但产孢量较少。

图1 供试球孢白僵菌菌株在SDAY 培养基上的菌落形态Fig. 1 Colony morphology of the tested Beauveria bassiana strains on SDAY medium

由表2 可见，9 株球孢白僵菌在SDAY 培养基上的菌落直径（F8,18=41.39，p<0.05）、产孢量（F8,27=58.00，p<0.05）和萌发率（F8,18=2.72，p<0.05）均存在显著差异。其中Bb22 菌落生长最快，15 d菌落直径为（53.00±1.73）mm；产孢量和孢子萌发率最高的是Bbz2 菌株，其次为Bb324 菌株。

表2 供试球孢白僵菌菌株在SDAY 培养基上的培养性状Table 2 Cultural characteristics of the tested Beauveria bassiana strains on SDAY medium

2.2 供试菌株对小地老虎的致病力

将各菌株配制为2×107孢子/mL 的悬浮液，接种小地老虎2 龄幼虫，计算试虫死亡率，结果见图2。从图2 可以看出，9 株球孢白僵菌对小地老虎幼虫均具有致病力，在接菌后3～6 d 试虫死亡率快速上升，随后趋于平稳。接种8 d 后，不同菌株对小地老虎幼虫的校正死亡率存在显著差异（F9,20=17.39，p<0.0001；表3）。其中以Bb324 菌株致病力最强，其侵染试虫导致的校正死亡率为70.37%，显著高于其他各菌株造成的死亡率。此外，Bb324菌株的LT50最短，为4.40 d。致病力最弱的菌株为Bb22，其接种8 d 后试虫校正死亡率最低，且LT50也最长（表3）。

图2 不同球孢白僵菌菌株处理后小地老虎2 龄幼虫的死亡率Fig. 2 Mortality of the second-instar larvae of Agrotis ipsilon infected by different Beauveria bassiana strains

表3 不同球孢白僵菌菌株对小地老虎2 龄幼虫的致病力Table 3 Pathogenicity of different Beauveria bassiana strains against the second-instar larvae of Agrotis ipsilon

2.3 Bb324 菌株LC50 及其侵染试虫症状

配制Bb324 菌株不同浓度孢子悬浮液，对小地老虎幼虫进行生物测定，结果见图3。由图中结果可知，随着Bb324 孢子悬浮液浓度的增加，试虫死亡率逐渐上升。2×108孢子/mL 处理组在接种后8 d导致的死亡率最高，为75.00%；2×107孢子/mL 处理组次之，死亡率为73.33%。而2×106、2×105和2×104孢子/mL 效果较差。表4 为计算得到的Bb324菌株的LC50，在接菌后8 d，该菌株LC50为2.92×107孢子/mL，显著小于接菌后4 d 和6 d 的LC50。

图3 不同浓度Bb324 孢子悬浮液处理后小地老虎2 龄幼虫的死亡率Fig. 3 Mortality of different concentrations of Bb324 conidial suspension against the second-instar larvae of Agrotis ipsilon

表4 不同处理时间Bb324 菌株的致死中浓度Table 4 Median lethal concentration of Bb324 against the second-instar larvae of Agrotis ipsilon at different times

小地老虎幼虫感染Bb324 后的症状如图4 所示。感染2 d 后，试虫身体弯曲，活动减弱；感染3 d后，试虫虫体蜷缩并死亡，足部、背部和头部均有白色菌丝长出；4 d 后虫体干瘪缩小，体表布满菌丝，并有孢子产生；5 d 后体表的菌丝产生大量白色分生孢子。

图4 Bb324 菌株侵染小地老虎2 龄幼虫不同时期的症状Fig. 4 Symptoms of the second-instar larvae of Agrotis ipsilon after inoculation with Bb324 at different time

3 讨 论

研究了9 株球孢白僵菌的生长速率、产孢量、孢子萌发率及对烟田小地老虎2 龄幼虫的致病力，最终筛选出了一株具有较高致病力的Bb324 菌株。虽然目前国内外已有少量利用球孢白僵菌防治小地老虎的报道[15-16]，但由于球孢白僵菌不同菌株之间的生物学特性以及对靶标害虫的致病力存在差异[17]，所以筛选小地老虎高致病性球孢白僵菌菌株仍然非常必要。本研究获得的Bb324 菌株为烟田小地老虎的生物防治提供了新资源。

前人研究表明，球孢白僵菌的生物学性状（如生长速率、产孢量和孢子萌发率等）与其对靶标害虫的致病力之间具有相关性[14,18]。因此在高致病力球孢白僵菌筛选中，菌株是否具有优良的生物学性状，是一项重要的考察指标。本研究发现，Bb324虽然生长速率并非最快，但其产孢量和孢子萌发率较高，且对小地老虎的致病力最高。因此，Bb324具有良好的生物学特性，这些特性非常有利于在田间环境中高效侵染小地老虎。本研究同时发现，虽然Bb22 在供试9 株真菌中生长速度最快，但其对小地老虎的致病性却最弱，这一现象可能与该菌株的寄主专化性有关[19]。

在试验中观察到Bb324菌株侵染小地老虎幼虫后，试虫活力减弱，虫体干瘪缩小。这可能是由于菌丝在试虫体内大量增殖，破坏虫体组织，消耗试虫营养所致[20]。进一步观察到Bb324 菌株在小地老虎幼虫体内增殖一定时间后，从体壁薄弱处穿出，试虫体表出现大量菌丝并产生大量孢子。这些新生的孢子可作为侵染源，持续控制烟田土壤中的其他小地老虎。此外，前人研究发现球孢白僵菌除了侵染靶标昆虫之外，可能对同一生境中的其他种类昆虫也具有致病效果。如庄宝龙等[10]从暗黑鳃金龟僵虫上分离的球孢白僵菌对亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）和二化螟（Chilosuppressalis）等害虫也具有很强的致病力；邝灼彬等[21]报道分离自小猿叶甲的球孢白僵菌能够侵染烟粉虱（Bemisia tabaci）、小菜蛾（Plutellaxylostella）和黄曲条跳甲（Phyllotretastriolata）。因此，本研究所筛选的Bb324 菌株可能也具有侵染蛴螬等其他烟田土栖害虫的能力。在后续研究中，将通过试验对这一推测进行证实。

需要说明的是，本研究是在室内控制条件下进行的，Bb324 菌株在田间环境的应用效果还需要进行大田防效评价。另一方面，本研究只评判了Bb324菌株对小地老虎2 龄幼虫的致病力，今后将关注该菌株对小地老虎不同龄期幼虫、蛹和成虫的侵染力，为小地老虎的绿色防控提供理论指导。

4 结 论

试验结果表明，9 株球孢白僵菌菌株具有不同的生物学性状，其中Bb324 菌株侵染小地老虎造成的死亡率最高，LT50也最短，并且该菌株在小地老虎僵虫上产生大量孢子，可能具有持续侵染效果。本研究为开发基于Bb324菌株的小地老虎生物防治技术提供了依据。