LncRNA MIR205HG靶向miR-299-3p调控肺癌细胞增殖、凋亡的机制研究

郭晓丹 马振禹 王晨静 韩天云 张飞燕

肺癌细胞恶性增殖及转移导致病人术后5年生存率降低,针对肺癌发生发展机制的研究可改善肺癌病人预后[1]。长链非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA)MIR205HG在宫颈癌和头颈部鳞状细胞癌组织中上调表达,敲减MIR205HG对宫颈癌和头颈部鳞状细胞癌细胞增殖及迁移具有抑制作用,并促进宫颈癌细胞凋亡[2-3]。但MIR205HG在肺癌中的表达及其可能作用机制尚未明确。starBase预测显示MIR205HG可能是微小RNA-299-3p(microRNA-299-3p,miR-299-3p)上游的调控基因,研究表明,miR-299-3p在肺癌组织中下调表达[4]。miR-299-3p在甲状腺癌、宫颈癌、肝癌等肿瘤中低表达,上调miR-299-3p表达可抑制细胞增殖及促进细胞凋亡[5-7]。本研究比较分析MIR205HG在肺癌细胞中的表达变化及其对细胞增殖、凋亡的影响,进一步探讨MIR205HG与miR-299-3p在肺癌发生过程中的相互作用关系。

对象与方法

一、对象

二、方法

1.试剂:H1299、A549、SPC-A1、BEAS-2B购于美国ATCC。Lipofectamine2000转染试剂购自美国Invitrogen;DMEM培养基购于Gibco;噻唑蓝(MTT)购于北京鼎国昌盛生物;细胞凋亡检测试剂盒购于上海雅吉生物;CyclinD1、Bcl-2、p21、Bax抗体购于美国Abcam;Trizol、逆转录及qRT-PCR试剂盒购于美国Thermo Fisher;miR-299-3p mimics、miR-NC、si-MIR205HG、si-NC、anti-miR-299-3p、anti-miR-NC购于上海吉玛制药;引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。

2.实验分组:采用脂质体转染法将si-MIR205HG、si-NC、miR-299-3p mimics、miR-NC、si-MIR205HG与anti-miR-299-3p、si-MIR205HG与anti-miR-NC转染H1299细胞,记为si-MIR205HG组、si-NC组、miR-299-3p组、miR-NC组、si-MIR205HG+anti-miR-299-3p组、si-MIR205HG+anti-miR-NC组。

3.qRT-PCR:采用Trizol法提取肺癌H1299细胞总RNA,反转录得到cDNA。引物序列如下:MIR205HG正向5'-GACCGTTGTTAGCACGCCTT-3',反向5'-CACGTATCGGTCCGTGTTGG-3';miR-299-3p正向5'-TTCAGTGTAAACATCCTCGACTG-3',反向5'-TGGCAATGTCGTGGAGTCG-3';GAPDH正向5'-CCACAGTCCATGCCATCAC-3',反向5'-GCTTCACCACCTTCTTGATG-3';U6正向5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3',反向5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'。以GAPDH和U6作为内参,采用2-ΔΔCq方法计算MIR205HG、miR-299-3p相对表达量。

图1 MIR205HG与miR-299-3p互补的核苷酸序列

5.MTT:H1299细胞培养24小时、48小时、72小时时加入MTT试剂,4小时后去除MTT,与150 μl DMSO室温孵育5分钟。酶标仪检测光密度值(OD 490 nm)。

6.流式细胞术:H1299细胞消化后加入200 μl Binding Buffer重悬染色。分析细胞凋亡率。

三、统计学处理

结果

1.MIR205HG和miR-299-3p在肺癌组织中的表达及其相关性分析:与癌旁组织比较,肺癌组织中MIR205HG表达升高,miR-299-3p表达降低(P<0.05),见表1。Pearson法,结果显示,MIR205HG和miR-299-3p呈负相关(r=-0.778 9,P<0.000 1),见图2。

表1 MIR205HG和miR-299-3p在肺癌组织中的表达

图2 MIR205HG和miR-299-3p相关性分析

2.MIR205HG和miR-299-3p在肺癌细胞和正常肺上皮细胞中的表达:相对于正常肺上皮细胞BEAS-2B,肺癌细胞H1299、A549、SPC-A1中MIR205HG表达升高(P<0.05),miR-299-3p表达降低(P<0.05),其中MIR205HG在H1299细胞中的表达相对较高,因而选用H1299细胞作为后续研究对象,见表2。

表2 MIR205HG和miR-299-3p在肺癌细胞和正常肺上皮细胞中的表达(n=9)

4.干扰MIR205HG表达对肺癌H1299细胞增殖和凋亡的影响:与si-NC组相比,si-MIR205HG组肺癌H1299细胞MIR205HG表达下降,增殖能力、CyclinD1、Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05),凋亡率、p21、Bax蛋白表达升高(P<0.05),见图3、表3。

表3 干扰MIR205HG表达对肺癌H1299细胞增殖和凋亡的影响(n=9)

A:干扰MIR205HG表达对肺癌H1299细胞增殖的影响;B:干扰MIR205HG表达对肺癌H1299细胞凋亡的影响;C:干扰MIR205HG表达对肺癌H1299细胞增殖和凋亡相关蛋白表达的影响

5.miR-299-3p过表达后肺癌H1299细胞的增殖和凋亡情况:与miR-NC组相比,miR-299-3p组肺癌H1299细胞miR-299-3p表达增高,增殖能力、CyclinD1、Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05),细胞凋亡率、p21、Bax蛋白表达升高(P<0.05),见表4。

表4 miR-299-3p过表达后肺癌H1299细胞的增殖和凋亡情况

6.抑制miR-299-3p逆转了干扰MIR205HG表达对肺癌H1299细胞增殖和凋亡的作用:相对于si-MIR205HG+anti-miR-NC组,si-MIR205HG+anti-miR-299-3p组肺癌H1299细胞miR-299-3p表达下降,增殖能力、CyclinD1、Bcl-2蛋白表达升高(P<0.05),凋亡率、p21、Bax蛋白表达水平降低(P<0.05),见表5。

表5 抑制miR-299-3p逆转了干扰MIR205HG表达对肺癌H1299细胞增殖和凋亡的作用

讨论

有报道显示,LncRNA在肺癌发生及发展过程中发挥重要调控作用[8-10]。此外,它可能为肺癌的诊断和靶向治疗提供一个潜在的靶点。然而,一些LncRNA参与肺癌发生发展的机制尚未完全阐明[11]。本研究积极探索LncRNA分子及其可能的作用机制,为肺癌的诊断和治疗提供新的方向。

有研究证实,MIR205HG在肺鳞癌中显著上调[12]。我们的数据显示,肺癌细胞中MIR205HG的表达增加,与文献一致,提示MIR205HG表达水平升高可能促进肺癌的发生。有研究表明,MIR205HG可抑制食管腺癌的进展[13]。证明MIR205HG在不同肿瘤类型中的不同作用。本研究结果显示,干扰MIR205HG表达使肺癌细胞增殖能力明显降低,细胞凋亡水平显著提高,提示干扰MIR205HG表达对肺癌细胞具有抗增殖和促凋亡的作用。CyclinD1、p21是增殖相关蛋白,CyclinD1表达水平与增殖能力成正比,p21表达水平与增殖能力成反比。Bcl-2、Bax是调控凋亡进展的蛋白,二者作用相反,Bcl-2表达水平与肺癌细胞凋亡能力成反比[14]。本研究结果显示,干扰MIR205HG表达后,CyclinD1、Bcl-2表达降低,p21、Bax表达升高,提示干扰MIR205HG表达对肺癌细胞的抗增殖和促凋亡作用与调控相关蛋白表达相关。

本研究通过双荧光素酶实验和RNA pull-down实验证实,miR-299-3p为MIR205HG的下游靶miRNA。既往研究表明,miR-299-3p在非小细胞肺癌细胞中表达水平降低,LncRNA RHPN1-AS1可通过靶向miR-299-3 /TNFSF12途径而增强非小细胞肺癌细胞化疗耐药性[15]。本研究结果显示miR-299-3p在肺癌细胞中的表达水平降低,与上述研究结果相似,miR-299-3p过表达导致肺癌细胞增殖抑制,使细胞凋亡能力增强,同时,CyclinD1、Bcl-2表达下降,p21、Bax表达增高,提示miR-299-3p通过调控蛋白表达抑制肺癌细胞增殖并诱导凋亡。进一步的实验显示,抑制miR-299-3p可逆转干扰MIR205HG表达对肺癌细胞增殖、凋亡及CyclinD1、Bcl-2、p21、Bax蛋白表达的作用,提示MIR205HG可通过竞争性结合miR-299-3p而抑制其表达从而发挥作用。

综上所述,MIR205HG在肺癌细胞中的表达量升高,并可促进肺癌细胞增殖及抑制其凋亡,其机制可能为MIR205HG抑制miR-299-3p的表达,miR-299-3p被证实是MIR205HG的直接靶基因,为深入探究MIR205HG在肺癌细胞中的调控网络提供理论依据,为揭示肺癌发病机制提供实验依据。