加味二陈汤诱导肺癌A549移植瘤细胞凋亡的实验研究

吴国玉，何粒芳，柯见龙，熊绍权

（成都中医药大学附属医院，四川 成都 610072）

肺癌是发病率和病死率最高的恶性肿瘤［1］，其中非小细胞肺癌是最常见的病理类型。中医药治疗肺癌有着扶正抑瘤并且无明显毒副作用的优势。中医学认为肺癌多有痰湿之证，如痰浊滞肺、痰瘀阻肺、痰热壅肺等［2-3］。有研究认为，痰证是肺癌最主要的中医证型［4］。临床常以二陈汤基于理气化痰理论来治疗肺癌，或以该方为基础方进行化裁，对晚期肺癌具有较好的治疗效果［5-6］。因此，本研究采用动物实验研究加味二陈汤抗肿瘤的效果，并进一步探讨其机制。

肿瘤的发生、发展与内质网应激有着十分密切的关系，内质网应激分子伴侣高表达是肿瘤发生的早期事件［7］；过强的内质网应激，会损害UPR 机制，调控分子伴侣蛋白，而抑制内质网UPR 机制，可启动内质网途径凋亡信号，起到逆转肿瘤耐药，增强肿瘤治疗的疗效［8］。因此，加味二陈汤的抗肺癌作用是否与调控内质网应激反应，调节细胞内质网凋亡途径有关？本研究对加味二陈汤可能引起内质网应激反应也做了初步探讨。

1 实验材料

1.1 实验动物和细胞株

SPF 级雄性BALB/C 裸鼠［四川科伦药物研究院有限公司，合格证号：SYXK（川）2013-184］，18 只，5 周龄，体质量（20±2）g，饲养于成都中医药大学实验动物中心（温度20 ℃、湿度40%）。肺腺癌A549 细胞株由成都中医药大学附属医院中心实验室提供。

1.2 实验用药

加味二陈汤组方：陈皮15 g，生姜10 g，天南星15 g，甘草5 g，川芎10 g，法半夏10 g，茯苓10 g；药材由成都中医药大学附属医院药剂科提供。将药物放入砂锅中，用清水浸泡半小时以上，煎煮20 min，煎好的药汁倒入碗中备用，用同样的方法再煎煮一次，然后将两次煎液混匀、过滤，经旋转蒸发仪旋转蒸发至浓度为4 g/mL，4 ℃保存备用。中药低剂量组以成人每日常规剂量为准，高剂量组以成人每日常规剂量的2 倍为准（依据“人与动物体表面积折算表”计算裸鼠的等效剂量）。

1.3 实验试剂

ATF4、CHOP、GAPDH 一抗（Sigma 公司，产品批号SAB2105294、SAB4500631、G9295）浓度分别为1∶500、1∶500、1∶50 000；水合氯醛（上海凌峰化学有限公司）；TUNEL 试剂盒（罗氏公司，批号：11767291910）；SDSPAGE凝胶快速制备试剂盒；BCA蛋白浓度测定试剂盒。

1.4 实验器材及耗材

旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；DH36001B型电热恒温培养箱（天津泰斯特公司）；Pipet-Lite XLS + 手动单道移液器（RAININ 瑞宁）；AXTDL5M-Ⅱ台式低速冷冻离心机（盐城市安信实验器械有限公司）；水域恒温振荡器（上海天进医疗器械有限公司）；酶标仪（美国biotek 公司）；MILLED 型普通光学显微镜（德国Leica公司）。

2 方法

2.1 构建A549肺腺癌移植瘤裸鼠模型

将DMEM 培养液置于37 ℃、5% CO2培养箱中，并将人肺腺癌A549细胞加入培养液。待A549细胞融合度达80%～90%，按 1∶3 分瓶传代培养，制备单细胞悬液。取处于对数生长期的A549肺癌细胞，用胰蛋白酶消化细胞，以台盼兰检测确保死细胞数＜5%。调整细胞浓度至1×107个/mL，于裸鼠于右腋皮下注射0.1 mL细胞悬液（接种量1×106个/mL）。

2.2 分组及给药

所有裸鼠接种4 d后均成瘤，10 d后裸鼠皮下瘤结节达3～4 mm。将18 只荷瘤裸鼠随机分为对照组、加味二陈汤低剂量组（简称中药低剂量组）、加味二陈汤高剂量组（简称中药高剂量组），每日灌胃0.2 mL 生理盐水和13、26 g/（kg·d）二陈汤水煎液，每天1 次，连续给药21 d。

2.3 检测指标

单细胞混悬液皮下注射成功后，用游标卡尺每隔4 d 测量裸鼠皮下瘤结节，即分别于第1、5、9、13、17、21天测量肿瘤长径（a）、短径（b）。

瘤重：给药21 d后，处死裸鼠，剥离肿瘤称取瘤重。

肿瘤生长抑制率（%）=（对照组平均瘤重 -治疗组平均瘤重）/对照组平均瘤重×100%

肿瘤体积V=1/2×a×b2

2.4 Western blot检测内质网应激相关蛋白表达

肿瘤组织解冻裂解，离心取上清，提取总蛋白，测定待测样品蛋白浓度，各组蛋白溶液按顺序每孔上样，电泳分离切割目标蛋白，将PVDF 膜浸入甲醇中，将目标蛋白和PVDF 膜叠放到一起，摇床缓慢摇动1 h；加入一抗（ATF4 1∶500；CHOP 1∶500），24 ℃孵育2 h；脱色摇床浸洗，二抗孵育37 ℃孵育；ECL 底物发光；暗室中曝光，扫描胶片，用凝胶图像处理系统扫描分析，以GAPDH内参为对照。

2.5 TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡率

将肿瘤组织置入胰蛋白酶K中固定后脱水、包埋、切片，分别加入TUNEL混合液、3号液反应，DAB显色，苏木素复染、脱脂、封片，每张切片选取5个400倍视野计数阳性细胞数和总细胞数。

凋亡率（%）=阳性细胞数/总细胞数×100%

2.6 统计学方法

采用GraphPrism6.0、SPSS21.0、ImageJ 等软件分析实验数据。资料采用±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD 法。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 各组小鼠肿瘤生长曲线、瘤重、抑瘤率的比较

中药低剂量组和中药高剂量组裸鼠肿瘤的生长速度、肿瘤体积、瘤重，与对照组比较均显著改善。中药低剂量组与中药高剂量组抑瘤率分别为21.4%、37%，表明加味二陈汤能明显抑制A549肿瘤生长及瘤重，且与剂量存在量效关系。结果见图1和表1。

表1 各组肿瘤体积、肿瘤瘤重、抑瘤率的比较（±s，n =6）

表1 各组肿瘤体积、肿瘤瘤重、抑瘤率的比较（±s，n =6）

注：与中药低剂量组比较，#P＜0.05；与对照组比较，*P＜0.05。

组别对照组中药低剂量组中药高剂量组肿瘤体积/mm3 1 450.90±319.20 1 166.20±363.90 889.60±280.60#瘤重/g 1.03±0.14 0.81±0.09*0.68±0.08*抑瘤率/%0.00 21.40 37.00

图1 各组裸鼠肿瘤生长曲线

3.2 各组小鼠肿瘤凋亡率，ATF4、CHOP 蛋白相对表达量的比较

中药高剂量组和中药低剂量组肿瘤凋亡率，ATF4、CHOP蛋白相对表达量均较对照组改善，且中药高剂量组的改善情况优于中药低剂量组。结果见表2～3，图2。

表2 各组肿瘤凋亡率比较（±s）

表2 各组肿瘤凋亡率比较（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05。

组别对照组中药低剂量组中药高剂量组n6 6 6凋亡率/%23±5 29±5 35±6*

表3 各组ATF4、CHOP蛋白相对表达量比较（±s）

表3 各组ATF4、CHOP蛋白相对表达量比较（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05。

组别对照组中药低剂量组中药高剂量组CHOP 0.39±0.08 0.53±0.08*0.82±0.09*n6 6 6 ATF4 0.35±0.06 0.52±0.08*0.73±0.06*

图2 各组ATF4、CHOP蛋白表达水平

TUNEL 法检测裸鼠肿瘤组织，凋亡细胞的细胞核呈棕色，为阳性细胞，非凋亡细胞的细胞核为蓝色，见图3。

图3 各组裸鼠肿瘤组织原位细胞凋亡检测

4 讨论

在肺癌治疗中，中医药治疗有扶正抑瘤、降低放化疗毒副作用、改善患者生活质量等优势［9］。研究证实，中医药可以通过多种途径，抑制肿瘤细胞增殖、侵袭，并且可以诱导癌细胞凋亡［10-11］。中晚期肺癌属本虚标实，本虚多为气虚为主，标实以痰湿多见。百病皆因痰起，故肺癌治疗中化湿祛痰尤为重要。国医大师周岱翰教授［12］认为，癌肿发生，皆因痰作祟。临床上肺癌患者痰瘀搏结则常常表现为咯血胸痛、咳嗽气促；痰浊蒙蔽清窍则容易发生肺癌脑转移。诸多研究表明，化痰之品能增加肿瘤细胞间的黏附能力，抑制肿瘤细胞向基质及血管侵袭，通过影响肿瘤细胞的迁移能力来抑制肿瘤的转移［13-14］。

二陈汤常被称为祛痰之通剂，可通过健脾和胃、理气以化痰。临床以二陈汤化裁，治疗因“痰”引起的各种病症，包括肺癌［15-16］。加味二陈汤在原方基础上加用川芎、天南星和生姜，为治疗湿痰流注之主方。该方以半夏、南星为君，化痰散结；陈皮、川芎理气化痰；茯苓健脾去湿，湿去则脾旺，脾旺则痰无由以生；炙甘草调和诸药，兼润肺和中。全方标本兼治，共奏理气健脾、化痰散结之功效。有研究报道，二陈汤联合铂类化疗不仅可以直接抑制肿瘤细胞增殖，还可通过干预VEGF/VEGFR-2 分子影响血管生成因子而间接抑制肿瘤细胞生长［17］。还有研究将二陈汤分别与不同疗效的中药联用后发现，二陈汤可增高脾指数、胸腺指数、外周血细胞及免疫细胞CD3+、CD4+、CD8+［18］。林洪生教授［19］认为痰与瘀邪毒侵肺是导致癌症的病理产物，痰瘀互结，脉络瘀阻，血不循经从而溢于脉外，肺失宣发肃降、痰湿阻肺，故临证可见咳嗽气促、痰中带血等，并擅长使用二陈汤作为底方加减运用治疗并取得较好效果。二陈汤加减方联合铂类化疗可改善患者肺癌相关症状如咳嗽、咯血等，还可以缓解疲倦、失眠、脱发等其他症状，修复化疗引起的免疫损伤［20］。

本研究结果显示，加味二陈汤可诱导人肺腺癌A549 细胞的凋亡，且呈浓度及时间依赖性，在中药高剂量组更加明显，且随着药物作用时间延长诱导肺腺癌A549 细胞的凋亡的效果更加明显。为进一步探究其机制，笔者采用Western blot 检测内质网应激相关蛋白表达发现，加味二陈汤低剂量组和高剂量组ATF4、CHOP 蛋白相对表达量较对照组均增高，且呈剂量正相关关系。由此可见，加味二陈汤抑制肺癌移植瘤生长，诱导细胞凋亡其机制可能与诱导内质网相关蛋白ATF4、CHOP 蛋白的上调机制从而完成其体外抗癌的作用有关。TUNEL 检测实验中对照组亦呈现一定程度的凋亡率，当然这并不排除TUNEL 在检测过程中，操作损伤细胞和坏死细胞当作了凋亡细胞，此外肿瘤细胞自我更新快，生长繁殖活跃，也存在一定数量的凋亡率。

5 结论

加味二陈汤可能通过诱导内质网相关蛋白ATF4、CHOP 的表达而有效肺腺癌A549 移植瘤的生长并诱导其凋亡，且加味二陈汤抑制肺腺癌A549移植瘤的强度可能与中药的药物浓度呈正相关。